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引言

传统香荚兰是通过茎插枝繁殖的，扦插可以确保后代拥有相同的基因型，然而同样存在极大的弊端——所有后代继承了母本对毒性及病原体的高敏感。

香荚兰天然繁殖存在困难，由于种皮非常坚硬，疏水性强，因此其种子萌发繁殖过程复杂且不稳定，深入了解香草种子的发育，特别是不透水的种皮的形成，将为香草种子的繁殖和遗传资源的保护提供新的思路。

在此基础上，笔者提出了一种用于成熟种子的预处理和培养未成熟种子的方法。

培养未成熟种子成功发芽的窗口期较短，木质素、酚类物质和/或植物色素在种皮中的快速积累可能严重抑制种子在45DAP后的萌发。

随着种子成熟，增厚和木质化的种皮在胚胎周围形成一层不透水的包膜，这可能在后续的种子发芽过程中诱导休眠。

为更好地了解种荚不同成熟度时期下的最佳种子成熟度和种子发芽率，还需要进一步的研究。

一、研究背景介绍

香荚兰是生产天然香草香精的重要热带兰花，原产于墨西哥和中美洲，在世界各地的许多热带地区都有种植。

由于香荚兰的成熟种子几乎不发芽，因此通常采用无性繁殖方法进行商业化繁殖，例如切茎或愈伤组织培养再生。

传统的种子繁殖可以产生具有不同基因型的后代，这对于在育种计划中产生新的性状是很重要的。

非共生种子萌发技术已广泛应用于许多兰花的商业繁殖，然而这种技术在一些温带陆生兰花上的应用是复杂的且受限严重。

据推测，某些兰花发芽率低的原因可能与种子成熟过程中种皮的不透水性或抑制萌发物质的积累有关。

成功的非共生萌发可能与收集种子的时间有关、培养基成分，如有机营养物、碳源、植物生长调节剂，光强度和温度范围和种子预处理。

像大多数兰花一样，香荚兰会产生许多含有球形胚胎，没有胚乳的种子。

然而香荚兰与其他兰花存在一个非常明显的区别，香荚兰的种皮是黑色且十分坚硬，与大多数兰花种子的薄透明种皮形成鲜明对比。

香荚兰的成熟种子通常发芽率很低，这可能是受到硬化种皮的不渗透性带来的限制。

尽管成熟种子的发芽率很低，但长期储存和长途运输等场景下使用成熟种子进行繁殖是较优的选择，因此，有必要找出打破香荚兰成熟种子休眠的预处理条件。

笔者试图通过本实验，建立一种有效的香荚兰非共生萌发繁殖方法。

我们首先测试了种子成熟度对非共生萌发的影响，并确定了培养未成熟种子的最佳时机。

为了提高成熟种子的萌发率，研究了次氯酸钠浓度和浸泡时间的不同组合对种子萌发的影响。

我们还记录了种子发育在一定时间尺度内的形态学、组织学和组织化学变化，从受精到种子成熟。

这些研究成果将为大规模繁殖提供见解，以满足商业需求和香草生产育种计划。

二、材料与方法

2.1 植物材料和种子收集

香荚兰花期一般在每年4月下旬，通过将花粉转移到同一朵花的柱头上进行手工授粉的。

定期收集发育豆荚，用于形态学测量、组织学和种子萌发实验。

荚开始成熟并变黄后，在每个实验中至少定期从三个豆荚中收集种子。

2.1 非共生发芽率的评价

不同发育阶段的荚果用1.8%次氯酸钠溶液加1滴润湿剂表面消毒15分钟。

表面消毒后，切开荚果，用钳子将种子勺到培养基上。

为了确保每个蒴果的种子质量和发育阶段，将每个蒴果的剩余种子固定在显微镜下检查。

所用培养基为1/2 Murashige和Skoog (MS) ，添加2 mg l - 1甘氨酸、0.5 mg l - 1烟酸、0.5 mg l - 1吡啶醇HCl、0.1 mg l - 1硫胺素、1 gl - 1色氨酸、20 gl - 1蔗糖，并用7 gl - 1琼脂。

调整pH值至5.7，在121℃、1.2 kg cm2下高压灭菌20分钟。

每个培养管(20 × 100 mm)中放入10 ml培养基，每个培养管约有100粒种子。

播种后，将培养物置于生长室内，在光照强度30μmol m?2 s?1的日光荧光灯下，在16/8 h光周期下培养，播种后60天记录发芽率。

2.4 种子预处理对萌发的影响

为了检验不同浓度和时间的次氯酸钠预处理对提高种子萌发的效果，在135 DAP的条件下从豆荚中收集成熟种子。

每次预处理取4个豆荚，将成熟的种子舀入试管中，然后加入30ml次氯酸钠溶液。

分别用0.5%、1%、2%或4%次氯酸钠溶液进行预处理，加1滴Tween 20并分别浸泡15、30、45、60、75、90分钟，对照组仅用水浸泡。

预处理后，用灭菌的蒸馏水洗涤种子3次，然后按上述方法在1/ 2ms培养基上接种，每个培养管约有300颗种子，培养条件和萌发记录与上述非共生萌发过程相同。

2.5 组织学和组织化学研究

收集发育中的种子，用0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)缓冲2.5%戊二醛和1.6%多聚甲醛，室温下固定48 h。

种子现在在乙醇中脱水处理，然后用树脂(3:1,1:1,1:3 100%乙醇:Technovit 7100，各24 h)逐渐浸润，再进行三次更换树脂。

将种子嵌入树脂中，使用旋转切片机切割成3 μm厚的切片。

这些切片采用周期性酸-希夫(PAS)法对结构碳水化合物进行染色，并用1% (w/v)氨基黑10B在7%乙酸中反染色或0.05% (w/v)甲苯胺蓝O进行一般组织学染色。

为了检测种子发育过程中表皮物质的沉积，切片用1 μ ml?1尼罗红染色1分钟，然后在自来水中冲洗3分钟。

在配备蔡司滤镜组15 (546/12 nm激发，590 nm发射)的epifluorescence microscope下观察尼罗红的荧光模式。

2.6 离体苗的生根与驯化

培养150天后，将带根的原球茎转移到幼苗生长培养基上——1/2 MS培养基中添加20 g l-1蔗糖、1 g l-1活性炭粉、20 g l-1马铃薯匀浆和7 g l-1琼脂，用于幼苗生长。

将培养基的pH调至5.6，在121℃下高压灭菌20分钟，取100 ml培养基加入500 ml培养瓶中。转入幼苗生长培养基后，将烧瓶置于生长室内，光照强度为30μmol m?2 s?1，光照周期为16/8 h。

在幼苗生长培养基中培养90天后，从烧瓶中取出约10cm高、4片叶片的幼苗进行驯化。

2.7 实验设计与统计分析

所有实验均采用完全随机设计，重复3次，每次处理12个重复培养管，每个培养皿种植1个外植体。

资料分析采用方差分析(ANOVA)，采用Fisher保护最小显著性差异检验，P < 0.05。

三、分析与讨论

3.1 采用非共生萌发技术可以在植物种子发育早期实现种子萌发

本次实验从施肥之日起至300 DAP间隔15 d收集不同发育阶段的种子，研究其在非共生萌发处理下的发芽率。

30 DAP后种子萌发，45 DAP时种子萌发率达到9.9%，是整个实验中萌发率最高的。

在60 DAP时，发芽率显著下降至约2%，并且这种低发芽率一直持续到90dap，后续在120 DAP到300 DAP期间几乎没有观察到种子发芽。

3.2 种子预处理对萌发的影响

次氯酸钠溶液预处理显著打破了非共生萌发处理下香荚兰成熟种子不萌发的局面。

在135 DAP下收集的种子用2%次氯酸钠溶液浸泡60分钟，然后进行非共生萌发培养，经过预处理后的种子发芽率超过5%。

由此可见，次氯酸钠浸泡处理对植物种子发芽率的影响随着次氯酸钠浓度的增加和浸泡时间的延长而增强。

进一步的实验观察中发现，在所有不同浓度的次氯酸钠溶液中，浸泡时间的影响在75 min时达到最大，4%次氯酸钠溶液处理75 min后，香荚兰成熟种子的种子发芽率可以达到10%以上。

3.3 豆荚、胚和种皮的发育

豆荚由子房发育而来，手授粉成功后，子房开始迅速扩大和伸长，荚果长度稳步增加，在35 DAP时达到最大尺寸(19.86±1.99 cm)， 49 DAP时荚果直径达到最大尺寸(12.57±1.09 mm)。

240 DAP时，荚果成熟并变黄，300 DAP后变为黑色。

豆荚中的胚胎是由花粉中的精子细胞和胚囊中的卵子结合而成的受精卵发育而成的。

大孢子母细胞在5月上旬授粉后发育，受精前在荚果中可观察到许多成熟胚囊。

30 DAP时，发育中的豆荚内存在合子和原胚，未观察到胚乳。

45 DAP时，内层和表层发生了额外的细胞分裂，从而导致胚胎正常生长，一些种子已经变成浅棕色。

60 DAP时，胚胎内部发生了更多的细胞分裂，导致早期球形胚胎，大多数种子已经变成黑色。

香荚兰在胚胎发育过程中缺乏结构明确的胚柄，当胚胎在75 DAP发育到球形阶段时，胚胎本身已经充满了胚囊的腔，在这个阶段之后，几乎所有的种子都是黑色的。

105 DAP时，成熟胚长约11个细胞，宽约7个细胞，未形成茎尖分生组织和子叶，胚胎固有细胞的细胞质中充满了大量的贮藏产物(如蛋白体和脂质体)，淀粉粒已经消失。

300 DAP时，荚果完全成熟并干燥，随后豆荚裂开，成熟的种子被释放。

在种皮的发育过程中，内种皮和外种皮分别由胚珠的内被和外被衍生而来，这两层截然不同的种皮包裹着成熟的香荚兰中种子胚胎。

种子发育的早期阶段，内种皮的细胞壁保持原始性质，而随着种子接近成熟，内种皮逐渐压缩，最终在成熟时变成薄层。

外种皮由3 ~ 4个细胞层组成，受精前，外种皮还在生长，还没有完全包围胚囊，此时种皮外壁细胞壁较薄，受精后种皮最外层细胞壁增厚。

60 DAP时，种皮最外层的增厚壁硬化，并且随着种子接近成熟，种皮的内层逐渐压缩并附着在硬化的种皮最外层。

用TBO染色下，种皮最外层的细胞壁被染成蓝绿色，这种蓝绿色表明细胞壁中存在酚类化合物。

胚体的表面壁和种皮的最内层和最外层的壁反应积极，这表明在这两层壁中可能有角质层物质的积累。

3.4 原球茎和幼苗生长

对于原球茎的发育，大部分胚在1/2 MS培养基上培养30天仍被种皮包裹，只有少数胚从种皮中脱出，可以视作种子萌发。

培养60 d时，幼嫩原球茎已经变成浅绿色，在原球茎基部出现了大量的根状突起。

培养90 d，原球茎扩大，呈深绿色，分化出茎尖分生组织，随后观察到第一根分化的发育原球茎。

培养150 d，原球茎进一步伸长，根系形成明显，再转到幼苗生长培养基上90天，幼苗长成藤蔓。

与许多兰花的种子不同，香荚兰的成熟种子是黑色且十分坚硬，在本实验中，在特定的时间阶段，我们对种子的形态和结构变化进行了观察研究。

组织学和组织化学结果表明，硬化主要发生在种皮的最外层细胞层，在其他香草科植物中也观察到了类似的种子硬化现象，如，Galeola septentrionalis和G. javanica。

它们的种皮是多层的，当种子成熟时，细胞壁在木质素聚合物的作用下严重增厚，种皮最外层的细胞壁被TBO染成蓝绿色，表明存在酚类化合物。

在许多植物的种皮中，酚类化合物，包括咖啡酸、竹酸、香豆素、绿原酸和阿韦酸，都可以经过酯化形成种皮结构。

酚类化合物在种皮中的积累抑制种子萌发，而在香荚兰中，通过进一步的核磁共振波谱分析证明了在种皮细胞壁的木质化过程中存在大量的儿茶酚沉积。

尼罗红染色后，在香荚兰内种皮细胞的最内层和球形胚的表面壁上观察到一层薄薄的荧光层，提示壁中有角质层物质的积累，在胚体表面和种皮最内层的角质层物质的沉积可能为发育中的胚胎提供物理保护，并确保保持水分。

本次实验主要探讨了种子成熟度和种子预处理对非共生萌发的影响，明确了香荚兰种子的最佳萌发时间为45 DAP，萌发率仅为9.9%,此时出现早期球形胚，种皮最外层细胞层增厚，但未发生严重木质化。

香荚兰种子的萌发模式与温带地区的陆生兰科植物相似，未成熟的种子比成熟的种子更容易在体外萌发。

在60dap下，萌发率急剧下降，这与种皮木质化的开始相吻合。

由于种皮最外层的细胞层已经木质化，在播种操作中可以观察到更强的疏水性,随着种子的成熟，外层种皮逐渐压缩成包裹在胚周围的一层厚且严重木质化的层。

低渗透性的种皮限制了水分的吸收和溶质的扩散，导致成熟种子萌发不良。

在查阅了许多历史研究资料后，我们提出了一种抑制机制的假想：温带地区的陆生兰科植物成熟种子的不良萌发可能是受到萌发的化学抑制剂的积累，例如Dactylorhyza和Epipactis, Calanthe和cypridium和Cymbidium中的酚类物质，使得胚难以获得萌发所需的水分和养分。

种子预处理可以通过改变种皮的物理完整性，从而释放休眠和增强萌发，进一步促进胚吸收水分、养分及氧气。

利用次氯酸钙和次氯酸钠等漂白溶液对种子进行预处理，可以极大地促进几种欧洲陆生兰花种子的萌发。

我们使用2%和4%的次氯酸钠溶液浸泡香荚兰种子，浸泡75 ~ 90 min可促进成熟种子的萌发。

扫描电镜观察发现，种皮被次氯酸盐氧化损伤，因此种皮对水的渗透性相对较好。

值得注意的是，我们使用了更强的浓度(4%次氯酸钠)和更长的时间(90分钟)对成熟的种子进行预处理，但最佳萌发率仍然较低，仅为12.66±1.14%，这种较低的萌发率也从另一个角度反映了香荚兰种子硬种皮极不透水的特性。

除物理休眠外，预处理后的种子萌发率低可能与种子内部的抑制物质积累有关，如ABA，这些抑制物质仍然不能被次氯酸盐溶液滤出。

香荚兰的胚胎组织可能对内源性ABA的存在高度敏感，具有较深的生理休眠。

还有一个可能的抑制因素推测源于植物色素的积累导致较深的种子颜色，而这种高分子量的色素源酚类物质的氧化聚合过程形成的。

在我们的种子预处理实验中，用强次氯酸盐溶液浸泡后，种皮仍然保持深黑色。

已知植物黑素为种皮提供额外的机械强度，保护胚胎免受损害，但植物黑素可以影响种子休眠和抑制种子萌发。

在紫锥菊和香草属植物中，当它们的果实成熟时，它们通常有鲜艳的颜色和/或令人陶醉的香味来吸引动物，如老鼠、蝙蝠或鸟类。

兰花种子普遍存在严重木质化的问题，硬种皮的种子传播策略涉及啮齿类动物——增厚的木质化种皮和积累的植物黑素可以保护种子通过动物消化道时的胚胎。

总结

在本次实验中，我们提供了一种相对可行的方案，通过种子非共生萌发来生产幼苗。

对种子发育过程中的解剖学特征进行研究后，我们发现这些特征与种子预处理对提高种子发芽率的影响有关。

想要成功培养未成熟种子，采种时机短且关键，在45 DAP(种子变黑之前)采种可获得最佳萌发，这个阶段的未成熟种子发育成球状胚，在种皮最外层有增厚的非木质化细胞壁。

60 DAP及以后阶段的种子发芽较差，随着种子接近成熟，外层种皮的最外层细胞壁木质化，最终在成熟时被压缩成一层厚的包膜。

甲苯胺蓝O染色时，种皮外壁呈蓝绿色，表明存在酚类化合物。尼罗红染色法检测到胚体表面和种皮最内壁有角质层物质。

为提高成熟种子的萌发率，建议用4%次氯酸钠溶液预处理75 ~ 90 min。

总结了实验过程和数据，我们认为，增厚和木质化的种皮，形成一个不透水的包膜，是造成种皮休眠的原因。

我们需要进一步研究种子发育过程中胚胎中内源性抑制因子(如ABA)水平的变化，这些研究将有助于充分解释平叶圆叶青种子发芽率低的原因。

参考文献

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段金玉,《香荚兰的快速繁殖》

段金玉,《香荚兰种子的无菌萌发试验》

林进能，《香荚兰生长发育与环境条件的关系》

韦霄，《香荚兰化学成分及栽培技术研究进展》