天津大学团队首次以玉米黄质为底物体外合成藏红花酸

藏红花是一种名贵的中药材，含有药理活性化合物和大量的风味化合物，它的主要活性成分之一是藏红花酸（Crocetin）。藏红花酸在中草药、食用色素和染料工业中有着广泛的应用。相关研究报告表明，藏红花酸及其衍生物可以用于治疗多种疾病，包括癌症、冠心病和高血压。

目前，藏红花酸可从藏红花柱头中提取、分离和纯化。不过，藏红花的种植成本高（约为 200 美元/公斤），且由于藏红花酸的含量低，导致了传统提取和纯化过程的成本较高。

对于藏红花酸的生物合成，已有不少相关研究。研究人员通过酶的筛选、底盘工程和发酵过程的优化，尝试让藏红花酸的从头合成走向商业化，但这些方法还不够高效和可持续。

近日，ACS Sustainable Chemistry Engineering期刊在线发表了题为“One-Pot Efficient Bioconversion of Crocetin from Zeaxanthin via a Dual-Enzyme System”的研究论文，天津大学的肖文海老师课题组首次创建了以玉米黄质为底物转化藏红花酸的体外合成方法，并调节了体系中双酶添加比例，完全去除了副产物 3-HACA。最终藏红花酸的生物合成速率为 1.48mg/L/h，同时 2h 内藏红花酸的转化率达到 80.8%。此外，本研究还探究了体系中酶的可重复利用性，将体系中的酶重复利用三次仍具有 34% 以上的活性。

（来源：ACS Sustainable Chemistry Engineering）

首次以玉米黄质为底物体外合成藏红花酸

玉米黄质主要来源于玉米胚芽，是合成藏红花酸等类胡萝卜素生物合成的重要前体。以玉米黄质（533 美元/500 克）生产藏红花酸（6941 美元/500 克）是一个增值过程。

此研究的关键在于酶的优化和副产物的去除。

以玉米黄质为底物合成藏红花酸的途径主要有两个步骤，分别由类胡萝卜素裂解二氧酶 2（CCD2）和醛脱氢酶（ALD）催化。

▲图丨从玉米黄质合成藏红花酸的示意图（来源：ACS Sustainable Chemistry Engineering）

肖文海等人建立了一个由类胡萝卜素裂解二氧酶 2（CsCCD2-M1（R192F/S323A））和醛脱氢酶（SynALD）组成的一锅式双酶反应系统。CsCCD2- M1（R192F/S323A）是该课题组在此前的研究中获得的一个CsCCD2 突变体，它对玉米黄质的催化效率比野生型（Kcat/Km）高12.48倍。

在建立CsCCD2-M1 和SynALD 表达系统时，为了提高双酶反应体系的催化效率，研究人员通过测试确定了最佳诱导剂浓度和温度分别是 0.1mM 和 16°C；此外，还尝试将伴侣质粒 pGRO7 与CsCCD2-M1 和SynALD 共表达，以提高它们的可溶性表达。

接下来，研究人员进一步确定最佳的底物-酶添加比例。

通过对 CCD2 和 ALD 的作用机制的分析，研究人员推断以玉米黄质为底物体外合成藏红花酸的过程如下：

CsCCD2-M1 裂解邻近 3-OH-β-离子环的 7,8 或 7 '，8 '双键，随后中间物 3-HAC 被SynALD 脱氢生成 3-羟基-β-apo-8′-胡萝卜素酸（副产物，称为 3-HACA）；在另一条途径中，通过CsCCD2-M1 和SynALD 的顺序反应合成了藏红花酸。

▲图丨通过对 CCD2 和 ALD 的作用机制的分析，研究人员推断以玉米黄质为底物体外合成藏红花酸的过程（来源：ACS Sustainable Chemistry Engineering）

文章中指出，研究中建立的一锅式双酶反应系统是将所有的酶和底物同时加入其中，副产物的出现表明，在催化过程中，由于酶之间的活性差异，可能存在竞争性催化。经检测，消耗相同数量的底物，SynALD 的催化效率是CsCCD2-M1 的 6 倍。

对此，研究人员采取了酶的比例优化方法来促进反应的流动，减少副产品的积累，并减少酶的消耗。

当调整CsCCD2-M1 和SynALD 的摩尔比为 6:1 时，3-HACA 在 2h 内就被消除了。

▲图丨以 5μM 玉米黄质为底物，加入 1μMCsCCD2-M1 和 0.17μMSynALD，反应时间为 6h（来源：ACS Sustainable Chemistry Engineering）

反应体系规模扩大 10000 倍，产品转化率仍稳定

基于前文确定的最佳参数，研究人员将反应体系扩大了 100 倍。在该反应体系中，藏红花酸的转化率约为 80.7%。

然后，为了降低酶在反应中的成本，提高酶在反应体系中的利用率，研究人员对体系中酶的可重复使用性进行了研究。系统中的酶被重复使用了三次，三轮反应中藏红花酸的转化率分别为 80.7%、58.1% 和 34.1%。

可以看到，虽然藏红花酸的转化率随着酶的回收而逐渐下降，但在第3轮结束时，仍达到了 34% 以上的转化率。

因此，研究人员进一步将反应体积扩大了 10000 倍，达到 2.0L。在大规模反应体系中，藏红花酸的生物合成速率达到 1.48mg/L/h，同时 2h 内的转化率和回收率分别为 80.8% 和 76.3%。

他们发现，反应体系从 0.2mL 扩大到 2L，表现出基本一致的产品转化率，符合预期。这些结果为藏红花酸的大规模生产提供了更有利和可靠的指导。

文章在讨论中指出以下几点：

1、体外藏红花酸生产系统比体内生物合成系统具有更好的合成效率；

2、这种高效省时的酶级平台生物合成高纯度藏红花酸的方法，为藏红花酸的工业化生产奠定了基础；

3、这项研究不仅提供了一种可持续的体外生产藏红花酸的方法，而且对快速构建具有复杂结构的高价值化合物的一锅合成提出了新的见解；为其他天然产品的单锅酶串联生产提供了良好的范例。

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