<<——【·前言·】——>>
小麦是一种重要的粮食作物，对世界粮食安全有着重要的影响。
小孢子是小麦的重要生殖细胞，其生胚诱导和绿色植物再生技术的研究，能够促进小麦产业的发展。
在生胚诱导和绿色植物再生技术中，温度是一个重要的因素，冷热休克对小孢子生长和植物再生能力具有一定的影响。
因此，本研究旨在探究冷热休克对小麦小孢子生胚诱导和绿色植物再生的差异影响，为小麦生产提供科学依据。
在用于小孢子培养的多个已发布方案中，几乎所有方案都采用一些类型的应激处理。
将小孢子从天然指定的花粉形成途径转换到一种替代的发育途径，引发体外发生，应激处理可能是不同的，包括冷热休克、糖饥饿和诱导化学物。
被处理的外植体类型也可能不同，包括栽培植株、离蘖、穗、小花、荚泡和孤立的小孢子，长期以来，冷休克已被认为对谷类作物中的荚泡培养有益。
冷预处理的一般策略涉及在体外培养之前将收集的禾本科草植株以低温(约4℃)储存数天，以剪取荚泡进行培养。
在经过冷预处理的荚泡培养中，观察到高胚块产量和双单倍体再生体产生率增加。
也有研究证实，将大麦禾本科草植株存放在4℃的冰箱中长达4周，以提高小孢子的双单倍体产生率。
通过热休克或饥饿处理，似乎会触发或增强小孢子胚形成。
当剪除的小麦荚泡经受高温（32℃-34℃）预处理时，观察到有更高的高胚块产量。
恶劣温度和营养饥饿的压力，导致孤立的烟草小孢子中胚芽的产量增加。
将剪除的小麦荚泡置于33℃的孵化器中处理后，在随后的小孢子培养中观察到更高的胚芽产量，但植物再生（PR）和绿色植物（GP）产生率仍然较低。
后来，发现一种联合热休克、营养饥饿和诱导化学物的预处理方案，能够进一步提高小孢子培养的效率。
暴露在0.3M甘露醇中的荚泡进行饥饿处理也能有效诱导小孢子胚形成，高温休克在单独与饥饿结合，似乎可以触发或增强小孢子胚形成。
当剪下的小麦荚泡经过高温（32℃-34℃）预处理后，观察到更高的高胚块产量，由于受到温度升高的压力和营养饥饿的影响，孤立的烟草小孢子中的胚芽产量增加。
当剪下的小麦荚泡在33℃的培养箱中进行处理时，在随后的小孢子培养中，也观察到更高的胚芽产量，虽然植物再生（PR）和绿色植物（GP）的频率仍然很低。
后来发现，通过热休克、营养饥饿和诱导化学物的预处理联合，可以进一步提高小孢子培养的效率，将花药置于0.3 M甘露醇中进行饥饿处理也能有效诱导小孢子胚形成。
即使是迄今为止报道的最有效系统，谷类作物小孢子培养中，更低绿色植物百分比或无色生物体，仍然限制了双单倍体在作物育种中更广泛的使用。
从小孢子衍生的胚胎体再生出的植株中，白化植株（AP）的比例可以在5%到100%之间变化。
小孢子培养中的再生体中白化植株是常见的，特别是对许多实用育种价值的基因型和后代。
通常认为，高白化植株是由于遗传或环境因素或两者的组合，但其基本机制尚不清楚，荚泡培养中绿色植物和白化植物的频率差异在文献中有详细记载。
同时预处理和体外培养中的物理和化学条件也被认为是低绿色植物百分比的贡献因素之一。
有人认为，文化中的高培养温度导致质体基因组的缺失，从而导致小麦发芽率的降低，虽然通过基因操作可以增加绿色植物百分比，但该过程复杂而耗时。
通过改变预处理和体外培养环境条件来改善 GP% 的可行方法对作物双单倍体的生产和利用具有益处。
一旦确定了最佳参数，预处理或体外培养中物理、化学条件的变化易于实施。
由于预处理期间升温被认为是低GP%的原因之一，而33℃的热冲击常用于诱导小孢子胚形成。
值得探究是否这样的热冲击确实对低GP%负有责任，荚泡/小孢子培养中另一个常用的预处理是长时间的冷休克。
实验的目标有三点：
1.测试不同的低温预处理相对于33℃热休克是否能有效触发小孢子胚胎发生；
2.研究不同基因型是否对冷热预处理的反应存在差异，如GP%的测量；
3.了解诱导培养期间的温度变化是否会影响GP%，这些结果有助于提高小孢子培养中的GP%。
<<——【·预处理的温度变化·】——>>
基于早期实验的结果，选择了三种基因型进行研究，这些基因型的GP%有所不同，Calorwa的GP%最低，Pavon 76次之，Chris最高。
三种基因型的种子均在Enconair（加拿大渥太华）GC-16生长室中培养。
当穗子中部花药中的大多数小孢子处于中至晚单核期时，进行分别取样，分别取样和处理按照方案进行。
对于冷休克预处理，立直的分蘖悬瓶在四个温度水平的冰箱中孵育：4℃、7℃、10℃和13℃，分别为2、6、10和14天。
然后按照方法分离、收集小孢子并与培养基混合，所有的培养皿都在28℃的培养箱中孵育胚胎体发育。
使用血球计数器计数和估算具有胚性的小孢子数，在每组小孢子培养开始后的40、45和50天记录每个处理的胚胎体数量。
已转移到再生培养基中的胚胎体直径最小达到0.2毫米，每个培养皿中尚未成熟的胚胎体进行估算，不进行转移进行植物再生。
表中呈现的数字包括已转移和未转移的胚胎体数量，对于热休克预处理，立直的分蘖悬瓶针对Calorwa和Pavon 76在33℃孵育52小时，在Chris上孵育72小时。
基于先前的结果，33℃温度下的这两个时间方案被认为对这三种基因型最为有效。
由于33℃预处理下小孢子的细胞分裂和形态分化更快，因此需要在培养开始后的35、40和45天计数和转移胚胎体进行植物再生。
<<——【·小孢子的分离和培养·】——>>
在冷或热休克预处理后立即进行分蘖消毒处理，使用20％的商用漂白剂进行处理，然后将穗子从靴子中取出。
小孢子的隔离、收集、诱导培养和植物再生的与预料中的相似。
为这些实验，仅使用从33℃预处理中分离的小孢子，大量孵育的小孢子在四个温度水平下进行胚胎发育：16℃、20℃、24℃和28℃。
由于在每个温度水平下孵育的小孢子是来自同一样本池的子样本，因此胚胎体的百分比应该相同，因此未收集该数据。
当胚胎体直径达到0.2毫米时，进行计数并将其转移到再生培养基中，计数和转移在培养开始后35、40和45天进行。收集PR%和GP%的数据。
<<——【·胚胎发育过程中的温度变化·】——>>
孵育分离的小孢子在四个温度级别下进行胚胎体发育：16℃、20℃、24℃和28℃。
由于在每个温度水平下孵育的小孢子来自同一样本池，因此具有胚性的小孢子鉴定率应相同。
当胚胎体直径达到0.2毫米时进行计数，并将胚胎体转移到再生培养基中，计数和转移是在培养开始后的35、40和45天进行的。
所有呈现的数据均为每个处理的四次重复样品的汇总均值，胚性小孢子鉴定率（EM%）是在培养皿中分裂的小孢子占总小孢子数量的百分比。
由于冷休克小孢子的第一次细胞分裂比热休克后的小孢子稍晚，因此只使用EM% 的峰值进行比较。
植物再生频率（PR%）定义为：从实际转移到再生培养基的100个胚胎体中再生植物的数量。
GP%被计算为绿色植物、再生植物总数的百分比，换句话说，总再生植物数（100%）包括白化和绿色植物。
<<——【·温度休克对胚性发育的影响·】——>>
一般而言，经过冷休克后分离的小孢子具有比经过33°C热休克后分离的小孢子更少的清晰特征（形状和细胞组织）。
经过33°C热休克预处理后分离的胚性小孢子呈现出明确的纤维状或“星状”结构。
核向多或少移动到细胞中心，中央液泡由从核周边向亚皮质质充暴放的胞浆呈放射状分散。
冷预处理的小孢子的特征则各异且不那么明确，在经过3-5天的胚胎体培养后，它们才达到类似于“星状”结构。
呈明确定义的胚性小孢子，在一周内迅速分裂形成多细胞结构，两周后形成前胚胎体，四周后形成成熟的胚胎体。
一旦将成熟的胚胎体移植到半固体培养基中，植株在十天内发育出来，其中有些是白化体，有些是绿色植物。
胚性小孢子（EM）、胚胎体、白化体和绿色植物（GP）的计数按照这种发育顺序进行。
在不同温度休克的培养中，与对照组相比，所有较低的温度水平都能在一定程度上引发小孢子胚胎发育。
4℃和7℃的较低温度比10℃和13℃能产生更高的EM%，这一趋势对所研究的所有三种基因型都成立。
冷孵育的最佳时长为6天和10天，对于4℃、7℃和10℃的三个温度水平中的每一个，6天或10天的孵育都能产生更高的EM%。
14天冷休克时发现EM%较低，2天的孵育产生的EM%最低，13℃的预处理，无论基因型和孵育长度如何，都呈现出较低的EM%。
10天或14天的13℃孵育还导致了更高的污染发生率。
因此，不会对13℃预处理进行PR%和GP%的进一步结果收集，被认为对胚性诱导无效。
在4℃-10℃的温度范围内，较低温度能产生更高的EM%，对于所有三种基因型，与其他冷休克相比，4℃温度预处理可获得较高的EM%值。
可是，标准的热休克仍然产生了最高的EM%，最佳的冷休克方案为这三种基因型产生的EM%平均值为17.3％，34.5％和30.7％。
很明显，如果只按照EM%进行衡量，热休克仍然是触发小孢子胚胎发育最有效的方式。
<<——【·温度休克对胚胎产量的影响·】——>>
为了抵消不同培养皿中总小孢子数量的差异，在1×104总小孢子的基础上进行胚胎体数量标定。
来自各种温度休克处理的胚胎体数量通常遵循相同的模式，即较高的EM%对应着较高数量的成熟胚胎体。
在冷休克预处理中，4℃的6天和10天孵育得到最多的胚胎体，其次是7℃的6天和10天孵育，然后是同期的10℃。
然而，即使从冷预处理中获得了最高的胚胎体产量，与来自33℃预处理的胚胎体相比，Pavon 76、Calorwa和Chris的降幅分别达到了31%、57%和69%。
对于所有三种基因型，两个最有效的冷处理期得出来的结果仍然有些不太符合预期。
<<——【·温度冲击对植物再生的影响·】——>>
由于经过13℃的预处理和孵育期为2天和14天的成熟胚胎体中EM％非常低，它们被排除在再生实验之外。
由热冲击预处理发展的胚体的植物再生率分别为Calorwa、Pavon 76和Chris的35％、61％和63％。
在所有三个温度水平（4℃、7℃和10℃）和两个处理期（6和10天）中，来自冷冲击的胚体的植物再生率均较低。
对于Chris和Pavon 76，植物再生率的差异具有统计学意义，但对于Calorwa则无显着性差异。
在每个基因型内比较三个冷温度水平和两个处理期的植物再生率时，发现没有显着的差异，表明它们对冷和热冲击的反应不同。
对于Chris来说，在所有的冷冲击预处理中，GP％没有统计学差异，并且与33℃的热冲击之间也没有差异。
Chris的GP％始终约为75％，对于Pavon 76，从冷冲击中获得了更高的GP％，相对于33℃来说要高。
不同冷冲击之间的GP％差异在统计上是不显着的，Calorwa在热冲击和各种冷预处理之间表现出最显著的GP％差异。
33℃预处理的GP％仅为5％，但冷冲击的GP％为28％- 34％，冷冲击的GP％比33℃热冲击高出五倍）。
Calorwa在所有冷冲击温度水平上均表现出五倍增加的GP％。
<<——【·胚胎发育过程中的温度变化·】——>>
与28℃的标准温度相比，胚性发育过程中的所有温度变化都未被发现有益。
对照组（28℃）产生了最多的胚体，其次是24℃和20℃，16℃产生的胚体最少。
在24℃和28℃之间，以及20℃和16℃之间，胚体的产量和GP％没有统计学差异，在所有研究的三个基因型中，这个排名是一致的。
在每个基因型内，观察到在28℃和24℃之间，以及20℃和16℃之间，植物再生和GP％之间没有显着差异。
然而，在28℃和24℃孵育产生了比20℃和16℃更高的PR％。在所有四个温度水平上，GP％没有显着差异。
诱导培养过程中的温度变化似乎比GP％更影响胚体数目和总植物再生。
<<——【·结论·】——>>
触发胚胎发生的预处理不仅会影响重新编程进行胚胎发生的微孢子数量，还会影响这些微孢子的胚胎体质量。
尽管不同的基因型对相同温度的预处理具有可检测的差异，但从目前的研究中明显出现了一些与温度水平有关的通用趋势。
首先，冷冲击预处理对微孢子的GP％与更高的联系，因此，对于天然容易产生白化病变的基因型，采用冷冲击是可取的。
其次，对于没有更高白化病变再生倾向的种质，33℃的热冲击仍然更有效地诱导微孢子的胚胎发生，并产生更高的绿色植株产量。
因此，应将这种温度下的热冲击作为小麦微孢子培养的默认预处理方法。
总之，对于对高温冲击敏感的基因型和育种品系（因此产生的GP％始终较低），应将温度范围在4℃至10℃之间的冷冲击作为一种可行的选择，以减少再生植物中白化病变的数量。
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