定向进化技术的出现极大促进了合成生物学领域遗传元件和蛋白的开发。传统的定向进化技术一般指的是针对靶DNA序列进行饱和突变或易错PCR后，转化至细胞中构建突变体文库，再经高通量筛选，最终获得所需的突变体。但是，这种方法往往消耗大量时间与成本，并且对于未知突变探索的规模和能够突变的DNA长度也有很大的限制。

连续进化是这一问题的新一代解决方案。连续进化的目的在于使细胞在胞内可对靶基因或靶DNA序列进行针对性的随机突变，而不影响其他基因，由此生成的突变以文库可直接用于下一步筛选过程，省去文库构建的繁琐步骤。目前应用最广泛的工具之一就是酿酒酵母的正交DNA复制系统 （OrthoRep） 。在这个系统中，正交的DNA聚合酶仅复制一段线性双链DNA质粒 （线性质粒） ，而不复制其他序列，这为突变的引入提供了良好的基础。通过设计易错的正交DNA聚合酶，则可在线性质粒上的靶基因中引入随机突变，实现仅通过简单培养细胞获得突变文库。

由于此系统操作简单、正交性好、突变谱广泛且可实现长达22kb DNA的随机突变等多种优势，自问世以来，已经成功在酿酒酵母中成功应用至多个案例。但是，由 OrthoRep 在酿酒酵母中进化出的基因表达调控元件或蛋白质可能更适用于真核生物而不是各种广泛应用的原核微生物，且酿酒酵母培养周期远大于多种模式原核微生物，因此多个团队曾尝试在原核微生物中构建此系统，但均以失败告终：

2023年7月13日，江南大学未来食品科学中心和生物工程学院陈坚院士团队刘延峰研究员课题组在Nature Chemical Biology上发表了文章Engineered bacterial orthogonal DNA replication system for continuous evolution”， 首次在原核微生物中建立了正交DNA复制系统，设计了相应的易错正交DNA聚合酶，并基于此系统实现了体内连续定向进化。

该研究选择了一种天然存在于苏云金芽孢杆菌的溶源性噬菌体的复制机器，其与OrthoRep中线性质粒具有类似的复制机制，其编码的DNA聚合酶以末端蛋白为引物，仅复制该噬菌体自身的双链线性基因组。研究人员通过将此噬菌体基因组中裂解与结构相关基因敲除，并替换以目的基因，首先构建了胞内的线性质粒。通过dCas9抑制实验，确认了此线性质粒仅由其自身编码的正交DNA聚合酶复制。然后，测试了线性质粒在宿主中的稳定性，发现在没有筛选压力的情况下，70代内几乎没有发现丢失现象。此外，通过诱导表达正交DNA聚合酶，可以实现线性质粒拷贝数在12.0 到79.3的控制。

接下来，研究人员根据此类DNA聚合酶的结构预测与保守序列分析，设计了一系列易错正交DNA聚合酶，实现了线性质粒高于基因组突变率6700倍。通过NGS分析，线性质粒的突变谱包括全部12种碱基替换，并且所有突变较为均匀地发生于整个线性质粒。更重要的是，过表达易错正交DNA聚合酶对宿主基因组突变水平无显著影响。研究人员将此系统命名为BacORep，利用该系统不仅成功进化出了适用于典型模式微生物大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的强启动子，还通过进化超过12kb的编码甲醇同化基因簇的线性质粒，大大提高了宿主对甲醇的利用效率。这些实例证明了BacORep是一种适用于原核微生物的强大的连续进化工具。

江南大学2018级博士田荣臻为论文第一作者，刘延峰研究员为论文通讯作者。

https://www.nature.com/articles/s41589-023-01387-2