虽然很多细胞生物实验室都擅长免疫荧光实验,但我却是我们实验室做这个的独苗,踩坑无数!一开始的时候,做爬片控制不好细胞密度,很难保证细胞生长在同一层面,最后不是染色不均匀就是脱片了;载玻片也不知道要用明胶包被,清洗的时候组织直接整片 say goodbye,气得导师直接派我去他好兄弟实验室取取经。结果发现人家用的都是一体化的免疫荧光染色载玻片,根本不用操心这些问题。

师姐辣评:「你努力了八百年才到人家起点……」(‍♀️‍♀️)

不论你是害怕高难度操作的 IF 新手,还是想省时省力的 IF 高手,今天无差别为大家送上一体化的「培养室-固定-染色-成像」免疫荧光解决方案!

µ-Slide 8 Well high 免费试用!

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无需包被爬片,快速染色无渗漏,节省试剂与细胞。

产品特点:

1. 多种几何形状可供选择,所有免疫荧光染色步骤均可直接在载玻片或培养皿中进行。

2. ibidi 通道载玻片非常适合精确交换少量、中等量。

3. 通道 µ-Slides 的盖玻片底部无需额外的盖玻片。

4. 在 ibidi 腔室载玻片中,带有可移除腔室的硅胶垫圈安装在标准载玻片上,适合长期储存装有盖玻片的样品。

那么,µ-Slide 8 孔独立高壁腔室载玻片是如何在实际科研中进行应用的呢?

现在以粘附的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在 µ-Slide 8 Well high 中培养和免疫荧光染色为例向大家介绍。

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Tips:在开始免疫细胞化学实验之前,需要检查几个重要参数,例如目标蛋白质的表达水平、最佳细胞密度、合适的细胞培养容器形状和底物/涂层以及确认最佳抗体稀释度。此外,IF 染色必须要有阳性和阴性对照,建议在实验前进行文献查阅调研。

实验主要包括四个步骤

培养室-固定-染色-成像

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1. 材料

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1.1.试剂和缓冲液

细胞培养:

• 人脐静脉内皮细胞(HUVEC、C-12203、Promocell)

• 胶原蛋白 IV(354233,康宁)

• 0.05M HCl(X942.1, Carl Roth)

• 细胞培养基:内皮细胞基础培养基(C-22210,Promocell)和内皮细胞生长培养基补充混合物(C-39215,Promocell)

• PBS(14190144,Gibco)

• 精氨酸酶(A1110501,Gibco)

免疫荧光染色:

• PBS(14190144,Gibco)

• 福尔马林,10%,即用型(HT5011,Sigma Aldrich)

• 抗 α-微管蛋白单克隆抗体(T5168,Sigma Aldrich)

• 抗小鼠 IgG-Atto 594 (76085 Sigma Aldrich)

• 鬼笔环肽 488 偶联物(ab176753,Abcam)

• 使用含 DAPI 的 ibidi 安装介质(50011,ibidi)

• Triton-X-100(A16046,赛默飞世尔科技)

• 通透缓冲液(PBS 中 0.5% Triton-X-100)

• 封闭缓冲液(PBS 中 1% BSA + 0.2% Triton X 100)

• 抗体稀释缓冲液(1% BSA + 0.05% Triton X 100 的 PBS 溶液)

• 牛血清白蛋白(BSA)(A1470-10G, Sigma Aldrich)

• ibidi 浸油(50101,ibidi)

1.2.设备

• µ-Slide 8 Well high,ibiTreat(80806,ibidi)

• µ-载玻片架(80003,ibidi)

• 标准细胞培养设备(移液器、无菌工作台、细胞培养箱、培养瓶、细胞培养基、血细胞计数器等)

• 配有滤光片组的倒置荧光显微镜

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2. 方法

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2.1.细胞培养

使用前请阅读说明 µ-Slide 8 Well high,ibiTreat,所有步骤均在无菌条件下操作。在开始实验之前,在标准细胞培养瓶中处理 HUVEC(例如,T75 培养瓶,在 0.05 M HCl 中涂有 6.7 µg/mL 胶原蛋白 IV 处理 1 小时),细胞粘附在底部。

Tips:细胞在实验当天应状态正常且汇合度合适。整个实验应尽量快的完成防止孔变干。如果没有另外说明,所有给定的体积都是按照每一孔,所有的孵育步骤都在室温下进行。

• 用 Accutase 处理培养的 HUVEC 1-2 分钟以进行分离。

• 收集细胞悬液,离心,用少量培养基稀释后进行计数;最终量取决于所需的细胞浓度。

• 计数细胞,在内皮细胞基础培养基和内皮细胞生长培养基补充混合物中,并调整到最终浓度为 2 x 105 cells/mL 。

• 打开 ibidi µ-Slide 8 Well high 的包装并将其放在 µ- Slide Rack 或合适的台面上。

• 每个孔中加入 250 µL 的 HUVEC 悬浮液。

• 盖上随附的盖子。

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2.2.固定、通透和封闭

• 为您的实验准备足够的通透缓冲液和封闭缓冲液。

• 使用细胞培养吸液装置从孔中吸出细胞培养基。

• 用 PBS 清洗细胞:将 200 µL PBS 缓慢加入每个孔中轻轻摇晃后吸出。

• 用 200 µL 福尔马林(10%)固定细胞 10 分钟。

• 弃去福尔马林并用 200 µL PBS 洗涤细胞 3 次。

• 将细胞在 200 µL 通透缓冲液中孵育 10 分钟。

• 弃去通透缓冲液并用 200 μL PBS 清洗细胞。

• 用 200 µL 封闭缓冲液封闭 30 分钟。

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2.3. 染色和封片

• 在封闭步骤中,准备足够的抗体稀释缓冲液来稀释一抗和二抗。

• 在抗体稀释缓冲液中稀释一抗(α-微管蛋白:1:200 稀释)。

• 加入 150 µL 一抗,孵育 2 小时(请注意,有些抗体需要在 4°C 下过夜孵育)。

• 用 200 µL Blocking Buffer 清洗两次。

• 在相同的抗体稀释缓冲液中稀释二抗和鬼笔环肽(anti-mouse-IgGAtto 594:1:200 稀释度;鬼笔环肽 488 偶联物 1:1000 稀释度)。

• 加入 150 µL 二抗,避光孵育 2 小时。从此时起,样品应尽可能避光。

• 用 200 µL Blocking Buffer 清洗两次。

• 清空所有孔。

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• 每孔加入一滴含有 DAPI 的 ibidi 封固剂。

• 避光保存直到成像。最好立即进行成像,放置较长时间可能会降低图像质量

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2.4.成像

• 使用合适的滤光片组在荧光显微镜下观察细胞,必要时使用 ibidi 浸油。

• (可选)覆盖图像以创建合并图像。

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3. 结果

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对 HUVEC 在 µ-Slide 8 Well high 中免疫染色的宽视场荧光显微镜观察。F-肌动蛋白细胞骨架被鬼笔环肽(红色)染色。α-微管蛋白抗体用于染色微管(绿色)。用 DAPI(蓝色)染细胞核。该图为尼康显微镜 60 倍油浸物镜拍摄。

免疫荧光染色是一种灵敏性很高的方法,需要大量的经验积攒和步骤优化。如果IF 染色未达到预期效果,可按照以下表格进行可能原因的排查。

高背景

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低信号或无信号

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内容策划:潘成
内容审核:朱卿

题图来源:视觉中国