与成骨和脂肪生成的直接细胞扩增方式不同，MSC软骨形成经历间充质凝聚，细胞通过广泛的收缩并建立N-钙粘蛋白介导的细胞-细胞间粘附，从而启动软骨分化。收缩是MSC软骨形成的先决条件，与2D基质相比，在3D基质中得到更好的支持。因此，3D培养被认为是MSC体外软骨形成的首选方式。细胞形态的动态变化由Rho相关激酶（ROCK）依赖性肌动球蛋白收缩驱动，并调节MSC整合来自微环境的机械和分子信息。细胞骨架结构的调节对于软骨生成的启动也至关重要，因为仅破坏肌动球蛋白收缩就足以防止间充质凝结并抑制软骨分化。
为此，四川大学的张兴栋院士团队设计制备了具有粘弹性的胶原蛋白水凝胶，通过调节基于ROCK依赖性的收缩力介导整体MSC软骨形成。相关研究工作以“Collagen hydrogel viscoelasticity regulates MSC chondrogenesis in a ROCK-dependent manner”为题发表在《Science Advances》期刊上。
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图1. 调节胶原蛋白水凝胶的自组装程度可调节粘弹性，而与初始弹性模量无关
通过调整胶原溶液的低温孵育时间，观察到胶原蛋白溶液浊度总体单调增加，长时间在冰上孵育，对应于更广泛的原纤维自组装。在37°C凝胶化过程中，低温孵育4 h胶原液的浊度明显高于平衡时0.5 h的胶原液浊度。延长低温孵育时间的胶原溶液最终产生具有更高自组装度的胶原纤维网络。
在这里，保持胶原蛋白浓度恒定，因此它们的初始弹性模量相同。随着低温孵育时间的延长，胶原纤维网络中建立了更多的弱相互作用，导致水凝胶的应力松弛行为不同，且随着低温孵育时间的延长，应力松弛时间先减少后增加，最快的应力松弛与4小时的孵育相关。通过控制低温孵育时间，制备了一系列表现出不同粘弹性行为的胶原水凝胶，与初始弹性模量无关。为了研究胶原蛋白粘弹性对MSC软骨生成的影响，选择0.5h和4h小时低温孵育的胶原水凝胶，对应于较慢和较快的松弛水凝胶进行以下实验。
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基质粘弹性调节细胞形态和肌动蛋白组织
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图2. 基质粘弹性调节细胞形态和肌动蛋白组织
为了研究基质粘弹性对3D培养中干细胞的影响，将MSCs封装在较慢和较快松弛的胶原蛋白水凝胶中。在较快松弛组中，富含黏着素的粘连在细胞突起的尖端突出，而包封在较慢松弛的水凝胶中的细胞表现出较小且分散的粘连。粘附介导的信号传导驱动细胞形态变化和伪足形成，以探索细胞周围环境。伪足的定量显示，较快松弛水凝胶中的细胞比较慢松弛的水凝胶中的细胞表现出更多和更长的假足。尽管定量分析发现细胞体积无显著差异，但在快速松弛的水凝胶中，细胞球形度明显降低。
肌动蛋白细胞骨架的共聚焦显示，在快速松弛的水凝胶中具有更有效的肌动蛋白应激纤维，而在较慢松弛的水凝胶中，肌动蛋白染色更像颗粒，在快速松弛的水凝胶中，表现出应力纤维的细胞百分比显着更高。这些结果表明，快速松弛的基质促进了肌动蛋白聚合和细胞内机械传递。
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松弛基质短期内缓慢促进软骨生成
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图3. 基质粘弹性在成软骨分化起始期和长期软骨生成期起不同作用
将间充质干细胞包封在较慢和较快松弛的胶原蛋白水凝胶中，并在成软骨培养基中培养发现。MSC软骨分化在第1天呈现较慢松弛水凝胶中SOX-9，ACAN和Col2a1上调。量化了软骨基质的主要成分硫酸化糖胺聚糖（sGAG），发现包封在较慢松弛的水凝胶中的MSCs沉积了显着更多的sGAG。为了研究慢松弛水凝胶中能否保持早期软骨形成优势，表征了软骨基质在后期时间点的沉积。在第7天发现快速松弛基质显著上调Col II和ACAN的基因表达。此外，两组细胞在第14天均呈现球形软骨细胞样形态，然而较快组细胞沉积的软骨基质明显高于较慢组。这些结果表明，较慢松弛的水凝胶诱导的早期软骨形成优势无法维持，而较快松弛的水凝胶在长期MSC软骨生成过程中促进了软骨基质沉积。
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基质粘弹性以 ROCK 依赖性方式调节 MSC
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图4.基质粘弹性通过调节ROCK依赖性细胞凋亡来调节细胞存活。
然后，研究人员探讨了慢松弛水凝胶中软骨生成优势不可持续性的原因。通过DNA定量评估MSC的变化，两组的DNA量都随着时间的推移而减少，但是快速放松的水凝胶中细胞的数量在每个时间点都显着高于慢松弛组。通过TUNEL染色评估细胞凋亡，在第3天松弛较慢的凝胶中更为突出，而在快速松弛的水凝胶中，细胞凋亡得到缓解。
明显的细胞起泡是肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架过度活跃收缩的结果，通常是ROCK依赖性细胞凋亡的前奏。在37°C下孵育0.5小时的胶原蛋白-MSC溶液凝胶化后，快速松弛水凝胶中的起泡细胞明显少于慢松弛水凝胶。培养3小时后，较慢松弛的水凝胶中仍有气泡细胞，而较快松弛的水凝胶中的大多数细胞分散。
这些结果表明，快速松弛的水凝胶通过抑制肌球蛋白过度活化来减轻细胞起泡。快速松弛的水凝胶通过以ROCK依赖性方式减轻肌球蛋白过度激活来抑制细胞凋亡，这可能是长期MSC软骨生成过程中上调软骨基质沉积的原因。
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基质粘弹性介导的长期软骨生成
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图5. 基质粘弹性通过调节ROCK依赖性细胞凋亡来调节细胞存活，从而介导MSC长期的软骨生成。
为了验证快速松弛的水凝胶通过抑制ROCK依赖性细胞凋亡来促进整体MSC软骨生成，在药物抑制ROCK途径后表征了细胞凋亡。用Y- 27632抑制ROCK和用布比他汀抑制非肌肉肌球蛋白II消除了第3天细胞凋亡的差异。此外，DNA鉴定显示Y-27632和布比他汀处理后较慢松弛的水凝胶中的细胞数量增加。
接下来，在用药理学抑制剂挽救细胞存活后表征两组中的软骨基质沉积。分析显示，在布比他汀和Y-27632处理后，慢松弛水凝胶中的软骨细胞样球形细胞形态，而快速松弛水凝胶中的细胞在处理后没有显着差异。基因表达分析显示，在布比他汀和Y-27632处理后，ACAN和Col1a2在较慢松弛水凝胶中的表达水平显著上调，而Y-27632仅在较慢的松弛水凝胶中促进sGAG沉积。
因此，用布比他汀和Y-27632抑制ROCK依赖性细胞凋亡促进了较慢松弛水凝胶的整体软骨生成，表明较慢松弛水凝胶中软骨优势的不可持续性归因于ROCK依赖性肌球蛋白过度激活诱导的细胞凋亡，而快速松弛的水凝胶通过减轻ROCK依赖性细胞凋亡来促进整体软骨生成，类似于ROCK途径的药理学抑制作用。
总结
在这项工作中，作者表明他们制备的这种具有粘弹性的胶原蛋白水凝胶可以通过调节基于ROCK依赖性的收缩力来介导整体MSC软骨形成。如果没有及时与周围基质建立相互作用，MSCs表现出持续的肌球蛋白过度激活，尽管这使得在软骨分化开始时促进 Sox-9 的表达，但持续的肌球蛋白过度激活会导致 ROCK 依赖性细胞凋亡，导致慢松弛水凝胶中软骨生成优势不持续。相反，在具有上调肌动蛋白聚合的快速松弛水凝胶中抑制了早期软骨形成分化，但通过减轻肌球蛋白过度激活来抑制ROCK依赖性细胞凋亡，从而改善了MSC软骨的持续生成。
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