大家好！为大家介绍一篇2023年7月发表在PNAS上的文章，题目为“A DNA-based hydrogel for exosome separation and biomedical applications”。本文中，作者发展了一种可用于复杂生物介质中外泌体（EXOs）特异性、无损分离的DNA水凝胶，其分离出的EXOs可直接用于临床血清样本中外泌体致病性microRNA的检测，进而用于人乳腺癌检测，以及大鼠模型中心肌梗死的治疗。文章的通讯作者是来自天津大学化工学院的姚池副教授和仰大勇教授，该课题组以生物大分子DNA为研究主线，聚焦DNA生物功能材料智能制造，理解生命系统运行机制，探索重大疾病的诊断治疗新途径。（网站介绍：http://chemeng.tju.edu.cn/cn/szdw#jiaoshou,http://www.yanglab-dna.com/index-CH.html）。

背景介绍

外泌体（EXOs）是一种由细胞分泌的直径为30-150 nm的脂质双层囊泡，已经被证明在细胞间通讯和生理病理过程调节中起到重要作用，是疾病诊断的生物标志物和潜在的治疗剂。分离高纯度、低损伤的外泌体对早期疾病诊断、发病机制分析、预后监测等下游应用至关重要，但现有技术难以从复杂生物介质中分离并进行分析。得益于DNA适配体的特异性识别，DNA适配体已被广泛用于目标细胞及细胞来源囊泡的识别。通过将适配体序列合理地整合到DNA网络中形成水凝胶，已经实现了对干细胞、淋巴细胞和癌细胞等特定细胞的方便、选择性、无损分离。选取EXOs所需适配体，利用DNA水凝胶从复杂生物样品中分离EXOs具有广阔前景。

设计思路

本文中，作者提出了一种可用于复杂生物介质中特异性无损EXOs分离的DNA水凝胶（图1）。DNA水凝胶由双滚环扩增（RCA）合成的超长单链DNA（ssDNA）构建，RCA模板中设计有识别EXOs上CD63的适配体（AptCD63），从而产生多价适配体。该超长ssDNA对CD63阳性EXOs具有高亲和力，可在进一步形成的DNA水凝胶中实现EXOs的特异性捕获和高效富集。作者将该DNA水凝胶应用于细胞培养基和患者血清中EXOs的选择性分离，分离得到的EXOs可以通过酶裂解或链置换从水凝胶中无损释放。在临床样本中，可实现外泌体致病microRNA（miRNA）的检测以及肿瘤细胞衍生EXOs的分离，并进一步将该DNA水凝胶分离得到的骨髓基质细胞（BMSC）衍生EXOs应用于了大鼠心肌梗死（MI）模型的治疗。

图1.用于EXO分离的DNA水凝胶的示意图

数据介绍

1）用于EXO分离的DNA水凝胶的设计与构建

该基于DNA水凝胶的分离技术包括三个关键步骤：①通过酶促扩增合成两条超长DNA链，②用低速离心预处理培养基，去除细胞和细胞碎片，③用DNA水凝胶分离EXOs（图1）。利用2个环状DNA（circ-DNA）为模板，可由RCA分别生产2个超长DNA链（DNA-chain-1和DNA-chain-2），其中circ-DNA-1中整合有AptCD63的互补序列，因此DNA-chain-1中包含有AptCD63的重复序列（多价AptCD63）（图1A）。预处理后，首先使用DNA-chain-1捕获EXOs，之后加入DNA-chain-2，DNA-chain-1能够与DNA-chain-2在氢键驱动下通过DNA链上的22-nt互补序列进行杂交，形成DNA水凝胶，封装捕获的EXOs，使其与其他成分分离。

作者首先验证了这两条DNA链能够形成DNA水凝胶。将两条DNA链的溶液混合于1.5 mL试管中，37°C下摇匀0.5 h，可形成大量DNA水凝胶（图2A）。流变学结果表明，存储模量（G′，~4 Pa）高于损失模量（G″，~0.5 Pa），体现了DNA水凝胶的固态和超柔软性（图2B）。通过扫描电子显微镜（SEM）和荧光显微镜成像呈现了DNA水凝胶的微尺度三维（3D）多孔结构（图2C，2D）。以超离提取BMSC衍生EXOs为例验证DNA水凝胶的构建和优化。为验证AptCD63适配体对EXOs的特异性识别，使用红色荧光染料CM-DiI染色EXOs，使用绿色荧光团FAM对AptCD63进行修饰，仅在存在适配体序列的实验组中观察到绿色荧光与红色荧光的共定位，表明AptCD63能够特异性识别EXOs（图2E）。接下来，用DNA水凝胶对EXOs进行了特异性封装测试。EXOs荧光能够与DNA水凝胶荧光很好地共定位（图2F）。三维叠加荧光成像结果显示，EXOs以荧光点的形式三维分布在水凝胶中，局部放大发现，一个大的荧光点中包含有一簇EXOs（图2G）。以上结果表明，EXOs被成功地封装在DNA水凝胶中。随初始EXO数量增加，封装的EXO数量逐渐增加，最终达到平台期，封装数量约为7.6×107个（图2H），表明50 μL DNA水凝胶最多可封装7.6×107个EXOs。

图2. 用于EXO分离的DNA水凝胶的构建

2）从DNA水凝胶中可控释放EXOs

利用DNA的酶降解特性，可使用脱氧核糖核酸酶I（DNase I）降解DNA水凝胶（图3A）。当DNase I浓度为0.1 U/mL时，60 min时DNA水凝胶的累积释放效率超过90%（图3B），而无DNase I系统中EXOs的累积释放率仅为6.54%。三维叠加图像显示，随着水凝胶的降解，EXOs的分布从三维变为单层（图 2G，3C）。上述结果表明，酶降解可以有效可控释放DNA水凝胶中捕获的EXOs。作者通过纳米颗粒跟踪分析（图3D）、透射电镜（TEM）（图3E）及western blot（图3F）检测表征了释放出的EXOs的尺寸、形态和生物标志物，结果表明该技术能够特异性分离EXOs并通过酶解释放保持有结构完整性的EXOs。

之后作者尝试利用链置换，在不分解DNA水凝胶的情况下，通过改变AptCD63的空间构型来降低AptCD63与EXOs之间的亲和力，从而实现EXOs的无破坏性释放（图3G）。作者利用与AptCD63完全互补的置换链（DSs）与AptCD63杂交，取代DNA水凝胶中捕获的EXOs。利用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可视化验证了链置换的竞争效应（图3H）。在具有不同碱基数的三种DSs链（DS15、DS20、DS32）中，DS32产生的竞争效应最显著，被选取用于后续实验。使用FAM标记DS32，荧光显微镜下可观察到，DS32能够与AptCD63水凝胶高效杂交（图3I，左）；将DiI标记EXOs封装于水凝胶中（图3I，中），加入DS32后红色荧光显著减弱（图3I，右），表明DS32可成功取代EXOs。通过纳米颗粒跟踪分析（图3J）、TEM（图3K）及western blot（图3L）检测验证了链置换策略释放出的EXOs的结构完整性。

图3. 评估从DNA水凝胶中释放EXOs的两种策略

  • 3）用DNA水凝胶检测外泌体miRNA

外泌体miRNA是一种可靠、无创的癌症早期诊断生物标志物，然而，EXOs的低丰度和繁琐的提取过程往往限制了外泌体miRNA检测的灵敏度。作者将寡核苷酸分子信标（MB）和单探针（SP）整合到DNA水凝胶中，开发了一种检测乳腺癌生物标志物外泌体microRNA-21（miR-21）的检测方法，具有较高的特异性和准确性。MB是一个发夹结构的DNA，5’端修饰有红色荧光团Cy3，3’端修饰有猝灭剂（BHQ2），SP是5’端修饰有FAM的ssDNA，MB与DNA-chain-1上的AptCD63序列杂交，SP与DNA-chain-1上的非适配体序列杂交（图4A）。此时，MB处于发夹状态，Cy3的荧光被BHQ2猝灭，MB与SP距离较近，SP上FAM的荧光被MB的BHQ2猝灭。

将与MB和SP杂交的DNA-chain-1加入生物培养基，AptCD63识别EXOs上的CD63后取代DNA-chain-1上的MB，使BHQ2的猝灭作用减弱，FAM的绿色荧光恢复。随后MB渗透到EXOs中，识别miR-21并杂交形成双链结构，导致BHQ2对Cy3的猝灭作用减弱，Cy3的红色荧光恢复。同时FAM的绿色荧光可作为内参，最小化EXO浓度对检测精度的影响，通过红、绿荧光强度比值反映外泌体miR-21的水平。采用3种miRNAs（miR-21、miR-27a、miR-375）和相应的MBs（MB-21、MB-27a、MB-375）在正交实验中研究了MB的特异性，并以不相关MB序列（MB-NC）作为对照，发现MBs的荧光强度不受非互补miRNA的影响，说明MB对miRNA具有特异性（图4B）。

将该分离检测技术应用于已证实存在差异表达的乳腺癌患者（BCs）临床样本中的外泌体miR-21检测。作者首先半定量检测了来自MCF-7、MDA-MB-231和BEAS-2B三种不同细胞系的外泌体miR-21。荧光显微镜观察包裹有这三种EXOs的DNA水凝胶（图4C）。计算红绿荧光强度比值以反映外泌体miR-21的水平，MCF-7 EXOs和MDA-MB-231 EXOs的比值分别约为BEAS-2B EXOs的3.42倍和6.47倍；使用RT-PCR再次检测这三种EXOs中miR-21表达水平，两结果趋势相似（图4D）。以上数据表明DNA水凝胶具有高精度半定量检测外泌体miR-21的潜力。

为了进一步评估该方法用于乳腺癌临床诊断的可行性，检测了15个乳腺癌患者和15个健康供体来源的血清样本中miR-21的相对表达水平。荧光显微镜观察捕获样本后的DNA水凝胶（图4E）并对比荧光强度比值，癌症患者样本的平均比值使健康供体样本的2.12倍，说明癌症患者样本中外泌体miR-21表达水平显著升高（图4F）。受试者工作特征分析表明该DNA水凝胶能够可靠区分癌症患者样本与健康供体样本（曲线下面积=1，图4G），分类具有100%敏感性和100%特异性（图4H），显示了该方法在乳腺癌临床诊断中的应用潜力。

图4. 用DNA水凝胶检测乳腺癌患者临床样本中的外泌体miRNA

  • 4）使用DNA水凝胶治疗心肌梗死

作者进一步将该DNA水凝胶应用于心肌梗死的治疗方法中。既往研究表明，BMSC衍生的EXOs能够有效改善心肌缺氧状态，修复梗死心肌细胞。DNA水凝胶能够在含血清的环境中被酶降解，逐渐释放EXOs；具有剪切稀释特性，可注射；具低细胞毒性，是局部给药和有效释放毒素的理想传递方式。

作者通过大鼠胸腔内注射GelRed染色水凝胶的荧光强度下降验证了DNA水凝胶在体内的持续降解。之后将含骨髓基质细胞（BMSC）来源EXOs的DNA水凝胶作为治疗剂应用于大鼠心肌梗死模型（图5A）。通过结扎冠状动脉左前降支（LAD）建立大鼠心肌梗死模型，在LAD结扎后立即将100 μL封装有~2×108 BMSC衍生EXOs的DNA水凝胶注射到大鼠心肌上，并在最后第28天通过超声心动图分析大鼠的心脏功能（图5B）。与正常组的大鼠相比，用PBS缓冲液处理的大鼠左心室内径尺寸（LVIDs）明显增加、左室射血分数（LVEF）（图5C）和左室分数缩短（LVFS）（图5D）显著降低，提示心肌严重缺血性坏死。经过含有EXOs的水凝胶处理，舒张期和收缩期LVIDs分别从12.13%和11.21%显著下降到8.78%和7.10%；LVEF和LVFS分别从18.80%和9.15%显著上升到45.01%和23.48%，表明该DNA水凝胶具有显著改善梗死心肌功能的治疗作用。

为了进一步评价DNA水凝胶的治疗效果，在最后第28天进行了组织学检查，通过对大鼠心脏石蜡切片进行Masson三色染色（其中胶原纤维化区域染为蓝色）定量分析心脏胶原形态（图5E）。结果显示，胶原纤维化面积到总左心室（LV）面积的平均比例分别为0.07%（正常）、22.41%（PBS缓冲液）、7.30%（仅DNA水凝胶）和2.62%（含BMSC衍生EXOs的DNA水凝胶，水凝胶+EXO），表明该DNA水凝胶治疗能够显著阻断胶原纤维积累（图5F）。此外，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP末端标记法（TUNEL）处理大鼠心脏石蜡切片，观察心肌细胞的凋亡情况，未经EXO处理的各组（PBS和水凝胶）在细胞核中显示出更强的绿色荧光，细胞凋亡水平更高（图5G）。而水凝胶+EXO组的凋亡细胞占总细胞总数的5.46%，明显低于PBS组（17.96%）和水凝胶组（16.17%）（图5H）。以上结果表明，该DNA水凝胶能够有效改善大鼠心肌梗死模型的心肌功能，防止心肌凋亡。

图5.用DNA水凝胶治疗动物模型中的心肌梗死（MI）

总结

本文提出了一种基于 DNA 水凝胶的分离策略，可实现复杂生物介质中 EXOs 的特异性、非破坏性分离。每 50 μL DNA 水凝胶可获得 8×107 EXOs 的分离效率，并且能够通过酶降解和链置换两种途径无损释放水凝胶中的完好 EXOs 。该策略无需专门设备和复杂操作即可有效富集特定 EXOs 并进行高灵敏检测，在乳腺癌诊断中可以 100% 精度检测临床乳腺癌血清样本，在心肌梗死治疗中能够显著预防大鼠心肌梗死模型的心肌凋亡，有望作为一种强大的生物技术，促进纳米生物医学中细胞外囊泡的发展。

https://doi.org/10.1073/pnas.2303822120

撰稿人｜范谦

校稿人 |Jialu Zhang

推送 | Jialu Zhang