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导读

传统的抗抑郁药治疗由于临床起效较慢和副作用等缺点难以满足当前需要。中药以其良好的疗效和较高的安全性受到人们的广泛关注。当归（AS）是近年来公认的抗抑郁中药。本研究旨在基于慢性不可预知温和应激（CUMS）大鼠模型上研究AS的潜在抗抑郁机制。本研究结合行为学实验、分子生物学技术和超高效液相色谱-三重飞行时间质谱仪（UPLC-Triple-TOF/MS），探讨AS潜在的抗抑郁机制。结果表明，AS可降低CUMS大鼠血清下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴激素含量，包括促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质素（ACTH）和皮质醇（CORT）。此外，AS调节CUMS大鼠CD4+ T淋巴细胞的百分比、CD4+/CD8+的比率以及血清细胞因子如IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α的水平。脂质组学研究表明，有31种脂质与抑郁症有关，AS可调节CUMS诱导的脂质代谢改变，尤其是鞘脂代谢。最后，CUMS大鼠海马鞘脂代谢途径中的关键蛋白，包括丝氨酸棕榈酰转移酶（SPTLC2）、神经酰胺合成酶（CerS2）、鞘磷脂酶（SPHK1）和中性鞘磷脂酶。AS可减轻CUMS大鼠神经内分泌免疫（NEI）网络障碍，恢复鞘脂代谢产物和关键蛋白水平。AS缓解CUMS大鼠抑郁样行为的潜在机制可能是通过调节NEI和鞘脂代谢紊乱。

论文ID

原名：The regulatory effect of Angelicae Sinensis Radix on neuroendocrine-immune network and sphingolipid metabolism in CUMS -induced model of depression

译名：当归对CUMS诱导抑郁症模型神经内分泌免疫网络及鞘脂代谢的调节作用

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：5.4

发表时间：2023.10

通讯作者：秦雪梅， 宫文霞

通讯作者单位：山西大学中医药现代研究中心

实验设计

实验结果

1. AS的质量控制

我们采用高效液相色谱法对AS的化学性质进行了表征。本研究对AS提取物中阿魏酸和E-藁苯内酯两种主要成分进行了质量监测，其含量分别为0.037%和1.557%。代表性的（图S1和S2）HPLC如补充文件1所示。

图1 本研究的动物实验方案。i.g.胃内给药。

2. AS对行为指标变化的影响

与对照组（CON）相比，CUMS大鼠在实验4周后体重显著下降。与CUMS组相比，AS和阳性（P，文拉法辛）药物治疗组大鼠的体重显著增加（图2A）。体重测定结果表明，AS能显著改善CUMS诱导的体重减轻。

在旷场试验（OFT，图2B）的结果中，与CON组相比，CUMS大鼠的跳跃网格数量和直立次数都显著减少。与CUMS组相比，低剂量（AS-L）、中剂量（AS-M）和P组可显著提高CUMS大鼠的跳跃网格数。AS和P治疗组的直立次数都有逆转的趋势，但与CUMS组相比没有统计学差异。这些结果表明，AS可以改善CUMS大鼠自主神经活动的丧失。

在蔗糖偏好测试的结果中（SPT，图2C），与CON组相比，CUMS组大鼠的糖水摄入量显著减少。药物处理后，AS-M、高剂量（AS-H）和P组的糖水摄入量显著增加。结果表明，AS-M和AS-H组能明显改善CUMS大鼠的缺氧状态。

在强迫游泳试验的结果中（FST，图2D），与CON组相比，CUMS组大鼠表现出更长的不动时间。与CUMS组相比，AS-M、AS-H和P组能显著缩短CUMS大鼠强迫游泳的不动时间。结果表明，AS能显著改善CUMS引起的大鼠行为绝望。

图2 AS对CUMS模型大鼠行为指标的影响。（A）各组大鼠28天时的体重。（B）旷场试验中的跳跃网格数量（i）和直立次数（ii）。（C）大鼠对蔗糖的偏好率。（D）强迫游泳不动时间。所有数据均以平均值±标准差表示，n=10。与CON组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＞0.001；与CUMS组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

以上结果表明，CUMS模型已成功构建，同时提示AS具有一定的抗抑郁作用。因此，我们在以下分析中讨论了AS对CUMS大鼠神经内分泌免疫网络的影响。

图3 AS对HPA轴相关激素的影响。用ELISA试剂盒检测血清CRH（A）、ACTH（B）和CORT（C）水平。所有数据均以平均值±标准差表示，n=10。与CON组比较，###P＜0.001；与CUMS组比较，***P＜0.001。

3. AS对神经内分泌免疫网络的影响

3.1 AS对HPA轴相关激素的影响

HPA轴是内分泌系统的重要组成部分之一。我们通过检测HPA轴激素的含量，包括血清促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质素（ACTH）和皮质醇（CORT）水平，来评估AS对CUMS大鼠HPA轴的影响。如图3A–C所示，与CON相比，CUMS大鼠的血清CRH、ACTH和CORT水平显著升高。与CUMS相比，AS组在不同剂量下血清CRH、ACTH和CORT水平显著降低。

图4 AS对免疫系统相关指标的影响。（A）流式细胞术对各组（n=5）中CD4（i）和CD8（ii）细胞数量的代表性图像。（B）各组中CD4+（i）、CD8+（ii）和CD4+/CD8+（iii）比率的水平。所有数据均以平均值±标准差表示。与CON组比较，##P<0.01；与CUMS组相比*P＜0.05。

3.2 AS对免疫系统相关指标的影响

我们测量T淋巴细胞亚群的水平（图4A–B）和几种免疫因子，以评估CUMS大鼠免疫功能的变化。外周血淋巴细胞亚群的测定显示，与CON组相比，CUMS大鼠的CD4+ T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比率显著增加（图4B）。与CUMS组相比，AS-L、AS-H和P组的CD4+/CD8+比值显著下降，P组CD4+百分比也显著下降。

如图5A–D所示，CUMS中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平显著高于CON组，而IL-4水平显著低于CON组。与CUMS组相比，AS和P治疗组的免疫因子（IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α）显著逆转。结果表明，AS-H对CUMS大鼠的免疫功能有明显的改善作用。

图5 ELISA试剂盒检测血清中IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α（A–D）的水平（每个试剂盒n=12）。所有数据均以平均值±标准差表示。与CON组比较，###P＜0.001；与CUMS组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4. 基于LC-MS/MS的血清脂质代谢组学

4.1基于LC-MS/MS方法的结果

如图6所示，基于LC-MS/MS方法（去除未知化合物后），我们共检测到8637种化合物。此外，我们还采用基于结构和合成途径的脂质分类方法对其进行了分类和处理。

在正离子模式下的6987种化合物中（图6Ai），28.54%是甘油脂质，其次是鞘脂，占23.83%。甘油磷脂、糖脂和其他化合物分别为19.79%、15.49%和8.73%。相比之下，固醇脂质仅占3.62%。而负离子模式下的1650种化合物中57.88%（图6Aii）是甘油磷脂，其次是鞘脂，占19.64%。相比之下，脂肪酰基、其他和糖脂分别为14.42%、6.30%和1.26%。从总数来看，前三名分别是排名第一的甘油磷脂（共2338种）、第二的甘油脂质（共1994种）和第三的鞘脂（共1903个）。随后的实验结果表明，CUMS大鼠的代谢紊乱与鞘脂代谢密切相关，因此我们在此先展示了鞘脂数据。图6B显示，我们共检测到1903种鞘磷脂，其中鞘磷脂种类排名第一（共603种），其次是己糖神经酰胺类（共372种），神经酰胺类排名第三（共306种）（其他测试细节如图S3所示）。

图6 （A）正（i）和负（ii）离子模式下血清中不同种类脂质的数量和百分比。（B）大鼠血清中正（i）和负（ii）离子模式中鞘脂种类的百分比。

4.2 AS调节CUMS诱导的血清代谢谱异常

如图7所示，多变量统计分析显示，正离子模式下CON和CUMS组样本的代谢谱显著分离（图7A–B），这进一步表明我们已经成功复制了CUMS模型。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型置换实验结果表明，该模型是可靠的，具有良好的预测能力，没有过拟合（R2Y=0.985，Q2Y=0.873，图7D）。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA，图7C）分析也用于最大化差异，以筛选基于CON组和CUMS组样本的差异代谢物。我们将S图的VIP值（VIP≥1）和t检验的P值（P≤0.05）相结合，筛选CON组和CUMS组之间的差异代谢物（图7E）。我们采用OPLS-DA对各组和质量控制组的样品进行分析。根据图7F，我们发现QC样品紧密聚集并靠近中心，表明仪器稳定，数据客观可靠，可用于后续分析。同时，各组的代谢谱明显分离，CON组和CUMS组的代谢谱有显著差异。而AS治疗组和CON组的代谢谱基本重叠，表明AS对抑郁症大鼠的代谢紊乱具有显著的调节作用（负离子模式下大鼠血清代谢物的多变量统计分析也能够解释图S4中所示的上述结果）。

图7 正离子型大鼠血清代谢产物的多变量统计分析。CON和CUMS组之间大鼠血清代谢物的PCA（A）、PLS-DA（B）和OPLS-DA评分图；（D）PLS-DA模型的验证图；（E）OPLS-DA的S图；（F）各组血清样本在OPLS-DA中的分布。PCA：主成分分析。

4.3 代谢产物的变化与途径分析

根据S图的VIP值（VIP≥1）和t检验的P值（P≤0.05），我们筛选出483种差异代谢产物（数据见补充文件2）。经过与数据库的比较和鉴定，我们获得了31种与抑郁症相关的潜在生物标志物（表1）。热图反映了所有潜在生物标志物的含量变化（图8A）。我们通过火山图对大鼠血清中的所有不同代谢物进行可视化（图8C）。

我们将这些重要代谢产物导入MetaboAnalyst数据库进行途径分析。KEGG通路分析表明，CUMS大鼠代谢紊乱的发生有两条重要通路，即鞘脂代谢和甘油磷脂代谢（影响>0.05，P≤0.01，图8B）。

表1 已在大鼠血清中鉴定出代谢产物表

在通路分析结果的基础上，我们应用相关性分析来探索血清鞘脂显著变化的代谢物与AS给药效果的潜在指标之间的潜在联系。如图8D所示，神经酰胺和鞘磷脂与NEI相关指标呈正相关，而二氢鞘氨醇和二氢神经酰胺与NEI相关性指标呈负相关。在选择的鞘脂中，神经酰胺和鞘磷脂与NEI相关指标的相关性高于其他鞘脂（包括二氢鞘氨醇和二氢神经酰胺），表明SM/Cer系统是抑郁症发展过程中鞘脂代谢途径的核心系统。

图8 （A）31种不同代谢物的热图。红色或蓝色表示不同代谢物含量的增加或减少。（B）AS对CUMS诱导大鼠治疗作用的相关途径。（C）差异代谢产物火山图，标记物质为鞘脂差异代谢产物。（D）鞘脂代谢产物与药效学指标的相关性分析。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，|r|≥0.45。

5.基于LC-MS/MS的血清脂质组学

5.1 鞘脂代谢产物的分析

基于通路分析和鉴定结果，我们进一步分析了与鞘脂代谢通路相关的代谢产物，以阐明鞘脂代谢途径中代谢产物的变化以及给药后AS的改善情况。这些鞘脂代谢产物在火山图中被标记（图8C），包括5个二氢鞘氨醇（dhSphs）、2个二氢神经酰胺（Cer_DSs）、2个神经酰胺（Cers）和7个鞘磷脂（SM）。图9显示了所有组中不同个体鞘脂代谢产物的变化。二氢鞘氨醇和二氢神经酰胺代谢产物在CUMS建模后显著减少，而在AS给药后显著增加。神经酰胺和鞘磷脂代谢产物在建模后显著增加，而在AS处理后显著减少。

图9 条形图，用于比较不同组中dhSphs（A）、Cer_DSs（B）、Cers（C）和SM（D）的相对含量变化。所有数据均以平均值±标准差表示，n=9。与CON组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与CUMS组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。由于检测到的5种dhSph的分子式（C16H35NO2）相同，我们通过序列号鉴定进行了区分。

5.2 AS对CUMS大鼠海马鞘脂代谢途径关键蛋白的影响

为了进一步探索鞘脂代谢的变化，我们测定了海马鞘脂代谢途径中关键蛋白的表达。免疫印迹结果显示，CUMS大鼠海马鞘脂代谢紊乱。简言之，丝氨酸棕榈酰转移酶（SPTLC2，图10A）在CUMS大鼠海马中的表达显著高于CON组，并且在AS-H处理后显著下调。中性鞘磷脂酶的水平（nSMase，图10C）和鞘磷脂酶（SPHK1，图10D）在CUMS大鼠的海马中与CON组相比显著降低。与CUMS组相比，AS-H处理后nSMase和SPHK1的表达显著升高。然而，神经酰胺合成酶的水平（CerS2，图10B）在CUMS大鼠的海马中显示出增加的趋势，但与CON组相比没有显著差异。与CUMS组相比，AS-H处理后CerS2水平显著下调。

图10 通过蛋白质印迹分析和代表性图像观察AS对海马中SPTLC2（A）、CerS2（B）、nSMase（C）和SPHK1（D）表达的影响。所有数据均以平均值±标准差表示，其中n=5。与CON组比较，##P<0.01；与CUMS组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

本研究采用行为学、生物化学和分子生物学方法研究了AS对CUMS诱导的抑郁症模型中NEI网络和鞘脂代谢的调节作用。我们发现AS通过调节NEI网络和鞘脂代谢紊乱表现出抗抑郁样活性。

CUMS模型目前被认为是一种可靠的抑郁症动物模型。结合OFT和FST等行为测试，该模型可以模拟抑郁症的发病机制，特别是神经内分泌系统活动的异常。因此，本研究重现了CUMS模型，并进行了行为测试，以探索AS的抗抑郁作用。结果表明，CUMS大鼠在行为测试中表现出快感缺乏、行为绝望和探索能力下降的情况，这与以往的文献报道一致。AS和文拉法辛可以逆转CUMS大鼠的抑郁样行为。

NEI系统的紊乱被认为在抑郁症的发病机制中起着重要作用。本研究通过检测HPA轴激素、T淋巴细胞亚群和多种免疫因子，探讨AS对CUMS大鼠NEI的影响。结果显示，CUMS大鼠血清HPA轴激素（包括CRH、ACTH和CORT）水平显著升高，这与先前的报道一致，而AS和文拉法辛治疗后这些激素水平显著降低。这些结果表明，AS能有效调节等神经内分泌系统相关激素的分泌，与文拉法辛类似。此外，CUMS大鼠存在细胞炎症因子紊乱，包括IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-4，这与先前的研究一致。T淋巴细胞亚群测定结果显示，CUMS大鼠CD4+百分比和CD4+/CD8+细胞比例显著升高，表明T淋巴细胞亚组失衡。然而，这一结果与之前的临床报告不一致，据推测，这与疾病的持续时间和严重程度有关。简言之，免疫反应可能在抑郁症早期被激活，导致CD4+和CD4+/CD8+细胞比例增加。然而，这种现象随着病情的加重而消失，严重抑郁症患者的T淋巴细胞亚群没有统计学差异。总之，抑郁症患者T淋巴细胞亚群的变化仍有待阐明。此外，由于实验条件的限制，本研究尚未测量更多免疫蛋白（如IgA、IgM等）或神经递质指标（如NE、5-HT等）的水平。在未来的研究中，应添加这些相关指标来证明与NEI网络的相关性。

图11 鞘脂代谢的主要途径。SPT催化鞘脂的初始从头生物合成（红色箭头）和棕榈酰CoA+丝氨酸转化为3-ketoshinganine。二氢鞘氨醇是在KDSR作用下由3-ketosphinganine分解代谢合成的。二氢神经酰胺经CerS乙酰化，DES去饱和合成神经酰胺。红色或蓝色箭头表示两种物质的合成之间的关系，例如酶CDase的作用介导神经酰胺合成鞘氨醇。在补救途径（蓝色箭头）上，神经酰胺是通过葡萄糖神经酰胺的回收而获得的。SM在鞘磷脂途径中将鞘磷脂水解为神经酰胺（蓝色箭头）。然后神经酰胺通过GlcT-1转化为葡糖基神经酰胺形成复杂的鞘脂，或通过CDase代谢产生鞘氨醇，通过磷酸化产生S1P。CDase，神经酰胺酶；CerS，神经酰胺合成酶；CERK，神经酰胺激酶；DES，二氢神经酰胺去饱和酶；GCas，葡糖神经酰胺酶；GlcT-1，葡萄糖神经酰胺合成酶；KDSR，NADH依赖性3-ketosphinganine还原酶；SPHK，鞘氨醇激酶；nSMase，中性鞘氨醇酶；SMS，鞘磷脂合成酶；SPT，丝氨酸棕榈酰转移酶。已确定的关键蛋白质用黄色标记。红色、灰色和蓝色方框表示CUMS大鼠与CON组大鼠相比鞘脂代谢物质水平的变化。

基于上述结果，我们认为CUMS大鼠的NEI网络受到干扰，给予AS和文拉法辛可以显著逆转CUMS大鼠的这种现象。先前的研究也在没有分子机制研究的情况下探讨了CUMS大鼠的NEI障碍。结合以往的研究，我们利用脂质组学技术探讨NEI网络障碍与脂质障碍的相关性。结果显示，CUMS大鼠的脂质代谢谱发生了显著变化，并得出结论，与NEI网络障碍最相关的途径是鞘脂代谢途径（图8B）。

鞘氨醇脂质是一类含有鞘氨醇骨架的两性脂质，是含有神经酰胺、鞘氨醇和鞘磷脂等物质的膜重要结构成分，参与各种细胞过程，如细胞与细胞的相互作用、细胞增殖、分化、凋亡和迁移。鞘磷脂代谢已被证明参与抑郁症的多种病理生理机制，包括HPA轴激活、神经退行性变和炎症。在本研究中，基于脂质组学分析结果，我们在CUMS大鼠中筛选并鉴定了鞘脂途径中的差异代谢产物，表明抑郁状态下鞘脂代谢的异常变化，这与先前的报道一致。然而，AS和文拉法辛给药后，CUMS大鼠改变的鞘脂可以保留，表明这些药物可以改善鞘脂代谢紊乱。一般来说，与文拉法辛组相比，AS组的鞘脂调节程度更高（图9）。分子生物学技术被用于验证脂质组学的结果，这使我们的结果更加准确和可靠。我们之前基于代谢组学的研究初步发现AS的抗抑郁作用与鞘脂的调节有关，这支持了本研究的结果。

研究表明，鞘脂代谢的鞘磷脂/神经酰胺（SM/Cer）系统在抑郁症的发病机制中起着重要作用，鞘磷脂已被提出可以作为抗抑郁治疗的新靶点。此外，神经酰胺代谢异常已被证明参与了NEI相关的抑郁症机制，鞘磷脂可介导细胞因子的变化。相关性分析结果表明，SMs和Cers与免疫功能指标和神经内分泌指标显著相关（图8D），证明CUMS大鼠NEI网络紊乱伴有鞘脂代谢紊乱。

本研究结果对揭示AS的抗抑郁机制具有重要意义，可能与调节鞘脂代谢和NEI网络改善CUMS大鼠症状有关。然而，这项研究的局限性仍然存在。首先，尽管几乎所有已知与该疾病相关的人类基因在大鼠基因组中都有直接同源物，但目前从CUMS大鼠身上获得的研究结果仍然有限。今后，应根据临床样本探讨NEI网络和鞘脂代谢中抑郁症的发病机制，使研究结果和结论更加科学。其次，尽管AS 75%乙醇提取物中存在活性成分，但本研究的药物制备方法不符合中医理论，本研究仅研究了预防性给药。因此，我们应该以更科学的方式使用AS的经典水提取物研究AS的相关机制，我们应在未来的研究中考虑治疗给药。第三，尽管本研究中使用的非靶向脂质组学方法有助于探索脂质代谢谱和相对含量的变化（图11），但它在反映脂质代谢产物的组成和含量变化方面仍然缺乏准确性。未来需要靶向脂质组学技术来定量分析脂质绝对含量的变化。最后，为了阐明鞘脂代谢和NEI网络在AS抗抑郁机制中的重要作用，可以通过体内外相关关键酶的敲除、抑制和过表达实验进一步验证。

结论

在本研究中，我们发现AS可以缓解CUMS大鼠的NEI网络障碍，并恢复鞘脂代谢产物和关键蛋白的水平。总之，AS缓解CUMS大鼠抑郁样行为的潜在机制可能是通过调节NEI和鞘脂代谢紊乱。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37769886/

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