类黄酮是一组有价值的化合物，具有多种健康益处。(2S)-柚皮素是一种重要的黄酮类前体，几乎可以合成所有的黄酮类化合物。

然而，当前的代谢工程策略并未充分利用细胞内碳源来合成(2S)-柚皮素。前体不足和碳代谢通量的损失严重限制了(2S)-柚皮素的微生物异源合成。

近日，江南大学周景文团队采用系统工程策略来高水平生产 (2S)-柚皮素。最终，在5L生物反应器中发酵后，(2S)-柚皮素滴度达到 3420.6mg/L，为迄今为止报道的最高滴度。该研究不仅为黄酮类化合物的高效生物生产提供了可能，也为通过细胞内碳源的集中利用来生物合成天然产物提供了思路。

黄酮类化合物是一组植物次生代谢产物，含有超过 15,000 种化合物，几乎存在于所有水果、蔬菜和药用植物中。由于其具有多种生理活性，例如抗癌、抗炎、抗氧化剂、抗疟疾和抗利什曼原虫，黄酮类化合物已广泛应用于化工、医药、食品、化妆品、农化等行业。

(2S)-柚皮素生产方法主要依靠从橙皮中提取，但存在生产效率低、培养周期长、提取成本高等限制，既不经济也不环保；此外，(2S)-柚皮素及其衍生物在生产方面依旧面临挑战。

因此，以酿酒酵母等为代表的微生物(2S)-柚皮素合成已经成为行业研究热点。

天然植物中的(2S)-柚皮素生物合成需要两种前体对香豆酸和丙二酰辅酶 A的共同参与，对香豆酸和丙二酰辅酶 A 的供应不足会影响(2S)-柚皮素的生产。其中，对香豆酸是由苯丙氨酸或酪氨酸分别通过苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyase，PAL）途径，酪氨酸解氨酶（Tyrosine ammonilyase，TAL）途径合成。

由此可看，芳香族氨基酸是必需的前体，团队系统地研究了酪氨酸和莽草酸途径相关基因对(2S)-柚皮素生物合成的影响。其所使用到的酵母菌株 E32 源自团队先前的工作。

▲图 | (2S)-柚皮素生物合成的酿酒酵母系统工程（来源：上述论文）

首先，将源自大肠杆菌的莽草酸激酶等变体引入 E32 中，得到菌株 HB01 和 HB02。但并未提高(2S)-柚皮素滴度；此外，酿酒酵母中的内院 TYR1 基因过表达也未显著提高(2S)-柚皮素滴度。

接着，团队分别构建了 ARO8 过表达和 ARO9 敲除的菌株 HB04 和 HB05。其中，ARO9 参与芳香族氨基酸的分解代谢。菌株 HB04 中(2S)-柚皮素滴度为 160.4mg/L，菌株 HB05 中(2S)-柚皮素滴度为 196.3mg/L。

HB06 是通过用葡萄糖调节启动子 PHXT1 替换分支途径 PHA2 基因的启动子而构建的。与菌株 E32 相比，(2S)-柚皮素滴度增加 19.6%，为 179.3mg/L。

为了确定对香豆酸对于(2S)-柚皮素生物合成的影响，研究人员构建了菌株 HB12，其在补充有 500mg/L 对香豆酸的 YPD 培养基中培养 120 小时，(2S)-柚皮素滴度增至 387.6mg/L 。

团队还探索了多个条件改变下，对于(2S)-柚皮素滴度的影响，最终将基因 TYR1、PHA2、ARO1、 ARO2、ARO3、EcaroL 和 ARO8 共表达并敲除ARO9，生成菌株 HB32，使(2S)-柚皮素滴度达到 347.5mg/L。这表明 PAL 和 TAL 途径以及上游芳香氨基酸途径的协同作用增强了工程菌株合成(2S)-柚皮素的能力。

生成 1 分子(2S)-柚皮素，除了需要 1 分子对香豆酸之外，还需要 3 分子丙二酰辅酶 A。因此，团队也探索了针对丙二酰辅酶 A 生物合成途径的限制。

首先，使用来自肠沙门氏菌的乙酰辅酶A合酶突变基因 SeAcsL641P 来替代 TAT1，敲除该基因会增加对香豆酸的产量。所得菌株 HB36 中的 (2S)-柚皮素滴度为 452.8mg/L。

与 ALD6 过表达相结合，所得菌株 HB37 产生的(2S)-柚皮素比 HB33L1 高 7.9% 。

由于乙酰辅酶 A 是细胞代谢中的中心分子，也是该代谢的重要前体，因此团队预计乙酰辅酶 A 供应的增强将促进向丙二酰辅酶 A 的转化。最终的结果是发现增加丙二酰辅酶 A 的供应会略微增加(2S)-柚皮素的产量。

作者还探讨了亚细胞器和细胞质之间的碳通量传输能力。过氧化物酶体柠檬酸合酶基因 CIT2 和线粒体丙酮酸载体蛋白基因 MPC1 和 MPC3 在菌株HB40 中单独过表达时，(2S)-柚皮素产量没有提高。然而，当基因（菌株 HB50）一起过表达时，与菌株 HB40 相比，产量增加了 9.4%。

随后，将线粒体载体蛋白基因过表达得到 HB53，(2S)-柚皮素滴度达到 729.6mg/L。

在 HB53 中引入来自圆红冬孢酵母的异源柠檬酸合酶基因 RtCIT1 ，以增强线粒体柠檬酸合成，得到菌株 HB54 中的 (2S)-柚皮素滴度为 771.5mg/L。

进⼀步尝试将草酰乙酸从细胞质回收到线粒体中，没有观察到 (2S)-柚皮素滴度的显著变化。酸性中间体的积累可能会影响 pH 稳态，导致发酵过程中细胞生长缺陷。因此，团队在菌株 HB54 的 YPD 培养基中添加了 1% CaCO3中和剂，使(2S)-柚皮素滴度增加至 986.2mg/L；最后，当菌株HB54 在 5L 生物反应器补料分批发酵中生长时，滴度增加至 3420.6mg/L。

▲表 | 不同菌种异源生产(2S)-柚皮素的比较（来源：上述论文）

总体而言，在这项研究中，团队利用酿酒酵母，通过使用内源途径增强、多途径协同工程、酶工程等策略解决前体供应问题，实现了高水平(2S)-柚皮素的生产。

最终得到的工程菌株缓解了类黄酮前体供应不足的问题，并减少了副产物的积累。这些工程菌株可用作高价值黄酮类化合物生物合成的基础，并提供了一个有前景的类黄酮生产平台。

值得注意的是，早在 2022 年，周景文团队曾从富含黄酮类化合物的植物中筛选，获得了四种比常用查尔酮合成酶基因（PhCHS）活性更高的查尔酮合酶 (CHS)。在这些 CHS 中，SjCHS1 在摇瓶中使（2S）-柚皮素滴度增加了 48.38% 。团队将酿酒酵母的天然前体途径优化与活性更高的 CHS 相结合，进一步将摇瓶中（2S）-柚皮素滴度提高至 203.49mg/L。

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