近日，南方科技大学医学 院鄢仁鸿课题组在Nature Structural & Molecular Biology期刊在线发表最新研究成果，题为 Structural insight into the assembly and working mechanism of helicase-primase D5 from Mpox virus 。

猴痘病毒是有包膜的双链DNA病毒，属于痘病毒科正痘病毒属。与大多数DNA病毒在宿主细胞核中利用宿主复制机器完成遗传物质复制过程不同的是，猴痘病毒这类痘病毒是在细胞质中使用自身编码的DNA复制机器完成这一过程的。目前已经鉴定发现猴痘的DNA复制机器有五个重要蛋白：DNA合成酶F8，加工辅因子A22，尿嘧啶DNA糖基化酶E4，ssDNA结合蛋白I3和解旋酶-引发酶D5。鉴于痘病毒的特殊复制方式，靶向痘病毒的复制机器被认为是控制病毒繁殖的重要手段。然而由于目前对痘病毒复制机器的工作机制的了解尚且不足，因此极大限制了相关抗病毒药物的开发。该文将研究目光聚焦于猴痘病毒解旋酶-引发酶D5，由于它在不同痘病毒中高度保守，所以是很好的广谱抗病毒药物靶点。

D5蛋白有两个主要的结构域，N端的引发酶结构域和C端的解旋酶结构域。为了探究D5的性质和功能，作者解析了8个不同状态的D5高分辨结构。D5是一个六聚体的状态，能观察到6个C端解旋酶结构域，由于N端引发酶结构域存在结构上的灵活性，仅其中两个结构中可以看到3个RNA识别motif和2个锌离子结合motif。根据样品制备条件不同，结构中的核苷酸结合口袋中分别观察到了结合的ATP，ADP，ATPS或者不结合核苷酸的状态，蛋白中间的DNA结合孔道中可以看到结合和不结合DNA的状态。

本研究解析了猴痘全长D5蛋白多种状态的高分辨率冷冻电镜结构，这些结构揭示了在ATP水解过程中D5沿着单链DNA (single-stranded DNA, ssDNA) 移动的特征。通过结构分析和解旋酶活性验证，作者发现当引发酶结构域被截掉之后或者引发酶结构域与解旋酶结构域的相互作用被破坏之后，D5能够持续将双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA) 解旋成单链DNA，这表明引发酶结构域可以调控解旋酶结构域的解旋活性。此外，作者在实验中捕捉到了DNA解旋过程中D5的两个中间态构象，证明了在解旋过程中，每消耗2个ATP分子，DNA移动2个核苷酸。综上，本文阐明了痘病毒中ATP水解与DNA解旋协同的分子机制。

图1 D5的N端结构域结构和生化分析

图2 D5工作过程的分子模型

综上所述，该项研究发现了D5蛋白N端引发酶对C端解旋酶活性调控机理，阐明了痘病毒中ATP水解与DNA解旋协同的分子机制，为科学界对D5解旋机理的认识做出了重要贡献。值得一提的是，该项研究是鄢仁鸿团队在2023年初解析了猴痘病毒复制酶全酶组装和工作机制研究工作的后续，这些研究进一步加深了对痘病毒感染过程DNA复制机理的认识，为后续广谱抗痘病毒药物的开发提供了关键线索。

南方科技大学医学院生物化学系鄢仁鸿教授和原研究副教授郭莹莹（现为海南大学生命健康学院研究员）为该论文的共同通讯作者。博士生李雅宁和朱婧为该论文的共同第一作者。

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