撰文 | Qi

液体活检，如细胞游离DNA（cfDNA）在肿瘤、产前检测和器官移植监测等领域有广泛应用，但其灵敏度还不足以完全满足各项目的需求，比如基于循环肿瘤DNA（ctDNA）的筛查会漏报接近40%的癌症晚期患者，而高达75%的术后微小残留灶（MRD）检测呈阴性的患者会出现复发【1-3】。目前，大多数提高灵敏度的尝试都集中在测序和分析等离体步骤，但归根结底，血样中的ctDNA含量稀缺才是主要原因。于是人们试图通过抽更多的血或进行大量血浆置换，以及侵入性手术直接从肿瘤部位取样或利用聚焦超声瞬时增加ctDNA脱落等方法来克服这一限制，但新的问题又随之而来，比如血浆置换伴随的风险和成本，以及活检和增强ctDNA脱落的手段需要事先了解肿瘤位置，因而不适合癌症早期筛查。

从另一个角度思考，血液中cfDNA（和ctDNA）的含量同时取决于其释放和清除过程的相对程度，前者由细胞更新驱动，后者主要由肝脏驻留单核吞噬细胞系统（MPS）的摄取和循环核酸酶的降解来完成【4, 5】，那么减弱体内这两种清除机制或许就能增加血样中的cfDNA含量。

为了验证这一猜想，来自麻省理工学院-哈佛大学布罗德研究所的Viktor A. Adalsteinsson团队等多在Science杂志上合作发表了一篇题为Priming agents transiently reduce the clearance of cell-free DNA to improve liquid biopsies的文章，他们通过两种策略：1）模拟体内cfDNA的纳米颗粒可被MPS摄取以减弱对内源性cfDNA的吞噬清除，2）设计可结合cfDNA的单克隆抗体（mAb），使其免受循环核酸酶的降解进而延长半衰期，这两种策略均可显著提高ctDNA的血浆获取率和对小肿瘤的检测灵敏度。

大多数cfDNA与组蛋白结合以直径约11 nm的单个核小体（mononucleosomes）形式在血液中循环。之前的研究发现MPS能摄取超过95%静脉注射的纳米药物，不仅会降低药物向肿瘤的输送效率，还会导致药物在肝脏中累积，已有团队尝试用纳米颗粒（如脂质体）与纳米药物竞争性被MPS“吃掉”的策略来缓解这一问题【6, 7】。基于这一思路，该团队检测了被脂质体预处理的小鼠单核巨噬细胞系J774A.1对Cy5标记的核小体的摄取率，观察到摄取抑制效果呈现出剂量依赖性特征，与此结果一致，他们将不同剂量的脂质体或PBS注入小鼠体内后测定纵向收集的血液cfDNA水平，证实了肝脏巨噬细胞可摄取脂质体以增加血样中cfDNA获取率。

随后，该团队检测了第二种策略对cfDNA的保护效果。他们将不同浓度的小鼠抗双链DNA（dsDNA）抗体35I9与荧光淬灭dsDNA探针共孵育，加入脱氧核糖核酸酶（DNaseI）后，DNA裂解产生的荧光信号随35I9浓度的增加而减弱，在小鼠体内，mAb处理也能显著延缓cfDNA的清除率。值得注意的是，在60分钟时cfDNA的获取率在mAb组和对照组之间相似，这可能是由于抗体Fc段能与巨噬细胞表面Fc受体结合促进了对抗体-抗原复合物的吞噬。基于这一结果，他们构建了已知会破坏Fc段与Fc受体结合但不影响与dsDNA结合的变体（aST3），与未经修饰的mAb和对照组相比，aST3可保护cfDNA免受DNaseI降解并能维持循环中的持久性，提高血样收集率。

以上两种策略均显示出积极效果，于是他们进一步探索这两种策略是否能改善肿瘤检测的灵敏度。首先，对小鼠静脉注射荧光素化的MC26结肠癌细胞系以建立肺转移模型，并于肿瘤进展不同阶段注射脂质体后1小时收集血浆样品分析。相较于对照组，脂质体的施用显著增加了血浆cfDNA浓度（1、2、3周分别增加7、14和28倍）和单核苷酸变异（SNVs）检测量（第3周达到90倍），这种作用在低肿瘤负荷小鼠中更为明显，而中高负荷组中，敏感性的改善幅度较小。与此类似，单抗保护策略也能显著改善低肿瘤负荷情况下的检测灵敏度。

图2. 脂质体可显著提高ctDNA采集率并改善小肿瘤检测灵敏度。

综上所述，这项工作证明脂质体纳米颗粒和dsDNA结合抗体aST3均能保护cfDNA免受机体的清除和降解作用，将血液中ctDNA分子的获取率提高至10倍以上，进而改善肿瘤检测灵敏度，这一策略对于癌症风险较高以及其他检测手段（例如成像）无法确诊的个体来说具有潜在的应用价值。

针对这项研究，来自奥地利格拉茨医科大学的Tina Moser和Ellen Heitzer在同期杂志上发表了题为Surpassing sensitivity limits in liquid biopsy ——Attenuation of cell-free DNA clearance in vivo is an alternative strategy to maximize recovery观点文章，他们提出虽然这种策略在临床前模型中能明显提高ctDNA检测灵敏度，但在制剂的安全性和耐受性方面，以及这种效果是否可以转化到人类患者身上仍有待确定。在未来，需要整合多种类型标志物（如RNA、外泌体、ctDNA、小分子代谢物）的数据，进一步提高液体活检的灵敏度和特异性。除了灵敏度这一挑战之外，当前迫切需要解决的问题还包括液体活检方案的标准化、实验室间的差异，以及关系到能否实现临床广泛可及性的技术/设备上的成本效益等。因此，学术界、工业界和监管机构之间的合作对于完善现有方法、克服这些挑战以彻底改变癌症诊断和治疗而言至关重要。

https://doi.org/10.1126/science.adf2341

制版人：十一

参考文献

1. M. G. O. Fernandes, N. Cruz-Martins, J. C. Machado, J. L. Costa, V. Hespanhol, The value of cell-free circulating tumour DNA profiling in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) management.Cancer Cell Int.21, 675 (2021). doi: 10.1186/s12935-021-02382-0; pmid: 34915883

2. A. R. Parikh et al., Minimal Residual Disease Detection using a Plasma-only Circulating Tumor DNA Assay in Patients with Colorectal Cancer.Clin. Cancer Res.27, 5586–5594 (2021). doi: 10.1158/1078-0432.CCR-21-0410; pmid: 33926918

3. E. J. Moding, B. Y. Nabet, A. A. Alizadeh, M. Diehn, Detecting Liquid Remnants of Solid Tumors: Circulating Tumor DNA Minimal Residual Disease.Cancer Discov.11, 2968–2986 (2021). doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-0634; pmid: 34785539

4. S. Khier, P. B. Gahan, Hepatic Clearance of Cell-Free DNA: Possible Impact on Early Metastasis Diagnosis.Mol. Diagn. Ther. 25, 677–682 (2021). doi: 10.1007/s40291-021-00554-2; pmid: 34427906

5. D. S. C. Han, Y. M. D. Lo, The Nexus of cfDNA and Nuclease Biology.Trends Genet.37, 758–770 (2021). doi: 10.1016/j.tig.2021.04.005; pmid: 34006390

6. B. Ouyang et al., The dose threshold for nanoparticle tumour delivery.Nat. Mater.19, 1362–1371 (2020). doi: 10.1038/ s41563-020-0755-z; pmid: 32778816

7. N. R. M. Saunders et al., A Nanoprimer To Improve the Systemic Delivery of siRNA and mRNA.Nano Lett.20, 4264–4269 (2020). doi: 10.1021/acs.nanolett.0c00752; pmid: 32357299