戊二酸（Glutarate）是一种重要的二元羧酸，属于关键的有机化工原料和中间体。戊二酸及其衍生物在化学、医药、建筑、农业等领域应用广泛，可应用于生产聚酯多元醇、聚酰胺等聚合物，亦可用于配制各种杀菌消毒洗液和药品。

基于微生物细胞工厂的生物合成法是一种绿色且具有规模化生产潜力的方法，不过这一过程中的低效率一定程度上阻碍了生物合成法生产戊二酸的应用。

为了解决低效率这一问题，江南大学的研究人员设计了一种从头合成戊二酸的代谢途径——AMA 途径，并通过代谢工程和蛋白质工程策略在大肠杆菌中高效生产戊二酸。其中，性能最优菌株生产的戊二酸滴度和生产率分别达到了 88.4 g/L 以及 1.8 g/L·h。论文中指出，这些发现对提高基于微生物细胞工厂生物合成戊二酸的效率具有重要意义。

（来源：Nature Communications）

该研究已于近日发表在Nature Communications上。论文的主要作者之一是江南大学生物工程学院教授刘立明，通讯作者是江南大学生物工程学院副研究员高聪。他主要从事合成生物学元件挖掘与代谢调控工具设计的应用研究。

戊二酸是哺乳动物赖氨酸分解代谢过程中形成的中间体，赖氨酸通过两种不同的途径降解为戊二酸，即 5-氨基戊酸（AMV）和尸胺（CAD）途径。这两种途径中产生的 AMV 会被 AMV 转氨酶和戊二酸半醛脱氢酶进一步转化为戊二酸。

现阶段，领域内已经尝试利用多种代谢工程策略构建更高效的微生物细胞工厂来生产戊二酸，包括谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、细长聚球藻和恶臭假单胞菌。比如说，工程化谷氨酸棒杆菌中 AMV 途径达到的戊二酸最高滴度为 105.3 g/L，工程化大肠杆菌中 CAD 途径达到的戊二酸最高滴度为 54.5 g/L。

不过，这两种途径都涉及四到五个催化步骤，还需要关键三羧酸（TCA）中间体 α-酮戊二酸的参与，这些可能会导致代谢途径效率受限。

在这项研究中，为了提高代谢路径的效率、提高戊二酸产量，该团队使用 iML1515 模型预测增加赖氨酸生物合成的关键基因靶标，增加戊二酸的前体库。在此基础上，研究团队设计了最短、更具优势的 AMA 途径，以葡萄糖为底物高效生产戊二酸。

首先，研究团队通过代谢工程策略，基于代谢模型 iML1515 从增加 NADPH 供应、提高赖氨酸核心途径效率以及加强氨转运方面改造菌株。试验结果显示，大肠杆菌 Lys5 中负责赖氨酸合成的代谢通量达到了最佳状态。与对照菌株 Lys 相比，菌株 Lys5 中的碳代谢通量转向赖氨酸合成途径。在不同的培养基进行发酵，Lys5 生成赖氨酸滴度和产率分别达到了 195.9 g/L 和 5.4 g/L·h。

▲图 | AM1 培养基中不同工程策略设计的菌株的赖氨酸产量（来源：上述论文）

之后，研究人员开始着手设计戊二酸生物合成途径。为了设计从赖氨酸起始的人工戊二酸合成途径，该团队开发了包含四个关键步骤的逆合成工作流程，总共确定了 6 种潜在的戊二酸合成途径。最后，该团队选择了涉及最少催化步骤的 AMA 途径进行验证，这一途径是从赖氨酸开始的最短反应步骤，包含芳香醛合酶（AAS）、单胺氧化酶（MAO）和醛脱氢酶（ALDH）三种酶。

然后，该团队将 AMA 途径分为两个模块，模块 I 包含两种用于将赖氨酸转化为戊二醛的酶，模块 II 包含一种将戊二醛转化为戊二酸的酶，尝试基于模块生产戊二酸。并通过将所选的三种酶纯化并以等摩尔比添加到体外重建系统中，证明了AMA 途径将赖氨酸转化为戊二酸的可行性。

接下来，将 AMA 途径引入 Lys5 得到了菌株 AMA01，该菌株产生出了 51.6 g/L 的戊二酸。不过，这一过程中，戊二酸滴度和中间体戊二醛的积累有限，这提示生产戊二酸的过程中存在限速步骤。

基于上面的实验，研究人员通过酶活性、催化效率和发酵条件确定了 AMA 途径中的限速酶——ALDH（乙醛脱氢酶），并详细探究了 ALDH 的结构和机制。他们通过 ALDH 对单醛底物的催化机制推测出一种 ALDH 催化机制，并利用过渡态理论计算确定 ALDH 的催化机制，其中整个反应可分为六个步骤。

这些研究结果支持了由戊二醛形成戊二酸的机制，但是两个主要因素限制了催化过程的速度，一是催化过程的启动速率，二是高能量障碍。最终确定了四个关键步骤，即步骤 1 和 4 中的 S→[TS1] 和 IN3→[TS4]，步骤 2 和 5 中的 IN1→[TS2] 和 IN4 → [TS5]。因此，通过重编程过渡态 [TS1]、[TS4]、[TS2] 和 [TS5] 降低能量垒可能是进一步提高 ALDH 催化效率的策略。

为了提高 ALDH 催化效率，该团队通过蛋白质工程对 ALDH 进行修饰改造，构建了不同的突变株。其中，突变体Mu5ALDHI90C/I212C/N94S/P95N/G210T比野生型 ALDH 的催化效率提高了 5.6 倍。将含 Mu5 突变体的菌株 AMA02 进行发酵试验，其比菌株 AMA01 的戊二酸滴度、产量和生产率分别提高 40.5%、33.3% 和 36.4%。

不过，在发酵结束时，研究人员发现菌株 AMA02 存活率下降了 59.3%。通过斑点检测发现，菌株 AMA02 对戊二酸表现出有限的耐受性，浓度为 70 g/L 时观察到最大耐受性。然后，研究人员尝试通过 RNA 测序比较菌株 AMA02 在有和无 70 g/L 戊二酸情况下的整体基因表达，阐明潜在的机制。他们发现过表达 cbpA 的菌株在暴露于 70 g/L 戊二酸时表现出良好的耐药性，以及达到最佳戊二酸产量。

▲图 | 戊二酸耐受性基因 cbpA 的鉴定（来源：上述论文）

进一步的测试结果表明，由 RBS07 控制表达 cbpA 的菌株（AMA04）表现出最佳的细胞存活率和戊二酸产量。试验结果还显示，与较高浓度戊二酸相关的毒性通过耐受基因 cbpA 的表达会减轻。

最后，为了进一步提高菌株AMA04合成戊二酸的产量，研究团队对代谢负荷和酶表达水平进行了优化，包括构建单载体系统 pETM6R1-ALDH-AAS-MAO（即菌株 AMA05），以及在单载体基础上通过酶表达优化构建菌株 AMA06。AMA06 菌株在营养丰富的培养基中生产戊二酸的滴度、产率和生产效率分别达到了 88.4 g/L、0.42 g/g 和 1.8 g/L·h。

“我们相信，本研究开发的工具和方法可以为当前高效生物合成单体提供一种平台性策略，并有潜力进一步应用于更经济地生产其他增值化学品。”

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