2024 年夜饭，吃了
寒假，过了
压岁钱，拿了
新学期实验，刚开始就喊「救命」……
（文中有惊喜）
师弟
师姐，救命～ WB 显影结束了你快看下，黑背景，怎么又是一张丑图！
条带倒是没有歪七扭八了，电压不能调太高还是有用的吧
师姐
背景黑可能是一抗效果不好了，你重复使用一抗了吧？用新的一抗，4℃ 孵育过夜试试看吧
师姐
Western Blot 作为基础实验之一，除了上述类似情形不少同学还会有以下疑问：
问题一：目的蛋白条带信号弱
可能原因及解决办法：
•抗体孵育不充分：（增加抗体浓度，延长孵育时间）
•洗膜过度：（洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween- 20）
• 目的蛋白含量过低：（适当增加样本上样量）
•抗体活性低或稀释比例不合适：（选择验证过有效且妥善保存的抗体，合理稀释抗体使用量）
•一抗与二抗不匹配：（针对一抗种属选择正确的二抗）
问题二：目的蛋白大小与预期不符
可能原因：蛋白有翻译后剪切或者修饰；蛋白形成了二聚体或多聚体；进行 SDS PAGE 时凝胶浓度选择不合适。
解决办法：查询文献验证是否有翻译后剪切或者修饰等情况；对聚体情况可增加蛋白变性处理的强度；根据目的蛋白大小选择合适的凝胶浓度。
然而有时候按照 protocol 认真做完，拿到曝光结果又是一堆没遇到过的问题：非特异条带、膜上有白点、条带畸形或者弥散……
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o 转印膜：NC 膜/ PVDF 膜选择的理论原理；
o 缓冲液：Towbin缓冲液/ Bjerrum Schafer-Nielsen 缓冲液/ caps 缓冲液的具体配方；
o 转印方法：湿转/半干转/电转等图解详细步骤；
o 操作方案：微量过滤/抗体剥离与重杂交/总蛋白检测/免疫检测的实验 protocol；
o 故障排除：蛋白与膜结合不佳/条带弥散或扭曲/无条带或者条带弱等常见问题解决方法；
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内容策划：潘成
内容审核：周育红
题图来源：图虫创意
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