氨基酸的精确鉴定和定量对于许多生物应用至关重要。

2024年3月5日，四川大学耿佳及陈路共同通讯在Nature Methods在线发表题为“Real-time detection of 20 amino acids and discrimination of pathologically relevant peptides with functionalized nanopore”的研究论文，该研究报道了一个铜(II)功能化的耻垢分枝杆菌孔蛋白A (MspA)纳米孔，它具有N91H取代，当结合机器学习算法时，它可以直接识别20种蛋白质原氨基酸。

验证精度达到99.1%，信号回收率为30.9%。在纳摩尔范围内证明了氨基酸超灵敏定量的可行性。此外，该系统还能够实时分析两种具有代表性的翻译后修饰(PTMs)，一种非天然氨基酸和十种使用外肽酶合成的肽，包括与阿尔茨海默病和癌症新抗原相关的临床相关肽。值得注意的是，该策略成功地从水解产物中区分出只有一个氨基酸差异的肽，并提供了推断肽序列的可能性。

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氨基酸是蛋白质的基本成分。它们是生物合成的原料，在各种生理和病理生理过程中起着重要作用，如表观遗传调控和肿瘤代谢。因此，以高时空分辨率检测和鉴定氨基酸是至关重要的，特别是在单分子蛋白质测序领域。由于选择性RNA剪接和PTMs，产生的蛋白形式非常复杂，并且包含无法直接从转录组获得的更深层次信息。此外，目前还没有类似DNA扩增的方法来扩增蛋白质。因此，很难使用基于质谱的方法从蛋白质组中鉴定低丰度蛋白质。为了解决这些问题，需要能够区分20种蛋白质原氨基酸的单分子测序方法。

基于荧光基团的技术允许特定的氨基酸，如半胱氨酸和赖氨酸，被荧光分子选择性修饰。然后，通过使用Edman化学对肽进行顺序降解，或使用单分子荧光共振能量转移(FRET)直接成像，可以从荧光信号中推断出标记氨基酸的相对位置。此外，荧光团标记的氨基酸氨基末端识别器已经被设计成可逆地结合特定的氨基酸。同一氨基酸的重复信号可以大大提高单分子肽鉴定的准确性。虽然这些方法具有高通量和可靠性，但化学家很难标记这20种氨基酸。对于无标记方法，隧道电流测量和分子连接等技术可以快速、精确地检测多达12种氨基酸，这对于蛋白质测序仍然不够。

氨基酸检测的实验装置及原理（图源自Nature Methods）

该研究报告了使用铜(II)功能化的MspA纳米孔直接检测20种蛋白质原氨基酸，检测限在纳摩尔范围内。在孔腔的收缩区引入组氨酸取代来构建铜离子的结合位点。铜离子与组氨酸残基结合后，氨基酸与铜纳米孔复合物之间的可逆配位可以产生明确的电流信号，可以检测所有20种蛋白质原性氨基酸，2种带PTMs的氨基酸(O-磷酰-L-丝氨酸(P-S)和Nε-乙酰基-L-赖氨酸(Ac-K))和1种非天然氨基酸(S-羧甲基-L-半胱氨酸(CMC))。此外，通过使用外肽酶分析肽水解产物的组成，鉴定了10种不同的肽。总之，该方法能够实时检测肽水解过程中裂解的氨基酸，并提供推断肽序列的可能性。

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02208-