微热成型用于在氧传感器箔中形成一系列微腔。可以在这些空腔中培养 3D 细胞聚集体，并且可以通过成像量化氧含量。在这种新平台技术的帮助下，现在首次可以在球状体和类器官的直接微环境中监测氧气，从而在体外创造近体内条件。
几十年来，细胞培养技术一直是基础研究和药物开发的重要工具。与 2 维培养方法相比，体外3D 培养显示出许多优势，因为细胞行为、代谢和形态等关键参数可以更好地模拟体内细胞状态，因此更适合作为动物试验的替代方案。然而，设置适当的培养条件以为细胞创造近体内条件往往被忽视。例如，细胞培养仍然经常在标准培养箱条件下进行，在补充有 5 % CO 的大气氧水平下进行2，这不一定是活组织中暴露的典型氧浓度细胞。这可能导致高氧状态，或在某些情况下导致缺氧，这将导致细胞应激。为了向培养的细胞提供更能反映体内条件的氧浓度，需要适当的测量技术。许多氧气测量方法，例如克拉克型电极在测量过程中消耗氧气，因此不适用于小规模培养。另一方面，光学氧传感器不消耗氧气，可以小型化并针对不同的应用以不同的设计制造，这使得这些传感器在细胞培养监测中越来越受欢迎。光学传感器基于荧光染料，与氧气发生反应，可以掺入水凝胶或纳米颗粒中。荧光染料也可以固定在聚合物薄膜中，并可以制造对氧敏感的传感器箔。这甚至可以使用适当的成像相机对整个区域的氧梯度进行二维记录。这种方法已经应用于许多微流控和芯片实验室应用。在这里，我们描述了基于光学传感器箔的具有氧传感功能的微腔阵列的制造。球状体可以在这些微腔中培养，氧气可以从上面的培养基中自由扩散到3D细胞结构中，从而产生接近生理的条件。VisiSens成像技术可以同时记录多个球体微环境中的氧含量，该技术可实现高通量和无标记的氧测量，而不会以任何方式干扰3D细胞聚集体。
具有氧传感功能的传感器阵列
为了构建微腔传感器阵列，将厚度为 50 μm 的聚碳酸酯薄膜涂有掺入聚合物中的氧敏感荧光染料 （PreSens， GmbH）。该传感器箔被放置在黄铜成型工具上，微腔阵列由微热成型工艺（卡尔斯鲁厄理工学院）创建。通过这种方式，可以产生精确的阵列，内微腔直径为300 μm，上端是外径为500 μm的斜面（图2 A，B）。微观结构几何形状不限于圆腔或此处提到的尺寸，可以根据客户需求进行定制。安装在CellCrown中™12 NX （Scaffdex） 细胞培养插件 微腔传感器箔有 12 孔规格（图 2 C，D）。在我们的研究中，传感器箔被证明对所应用的细胞类型是无毒的。细胞直接生长在氧敏感层上;等离子体处理和胶原涂层的传感器箔甚至显示出增强的贴壁细胞生长。另一方面，BIOFLOAT™ （FaCellitate） 处理可防止贴壁细胞生长，从而通过将细胞直接移液到腔中（自组装）来形成球状体。这提供了一种获取 3D 细胞聚集体的方便直接的方法。
3D培养中的时空氧测量
将带有传感器阵列插件的板放置在相机上方的腔室中，VisiSens系统从下方拍摄氧气图像（图4A）。这样，就可以对整个插入区域和大量球体进行实时氧测量。与目前可用的其他 3D 细胞培养监测系统不同，在这种设置中，微腔在球状体培养和测量期间保持开放，因此不存在缺氧风险（图 6）。氧梯度与O相对应2从微腔上方的培养基扩散到相当于体内天然血管系统的细胞聚集体。只有从上面才能扩散，因为传感器微腔从下面形成扩散屏障（图 5）。微腔的特殊形状允许检测腔中心球状体直接微环境中的氧含量，因此可以验证生理学。同时，可以评估斜面中的扩散区，即朝向微腔边缘的区域（图5）。图 7 显示了一个传感器阵列的氧气图像示例，该阵列总共有 120 个微腔。感兴趣的区域可以选择在微腔的中心，通过3D细胞培养的最长氧扩散距离，以及在内斜面和外斜面区域，扩散区域，并且可以进行比较。在微腔阵列中，由于梯度分别进入每个腔，因此各个测量值彼此独立。各个边界层永久提供 O2通过上覆培养基，与体内情况相同。
许多应用的新视角
这种具有氧传感功能的培养平台可以测试药物活性化合物对细胞代谢的影响。由于微腔简化了大量创建 3D 细胞聚集体的过程，在一个 12 孔板中最多可创建 1400 个球状体，因此该方法不仅节省了检测时间，而且还能够创建大量数据进行比较。由于细胞在测量过程中不会改变，因此它们甚至可以用于下游处理/分析。在最初的概念验证实验中，该装置用于线粒体应激测试，在添加相应的测试物质后，可以在 3D 细胞培养物中检测到预期的氧浓度（图 8）。目前正在进行研究，以建立使用微腔传感器阵列对药物进行心脏毒性测试的方案。
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