糖基化，是在酶的控制下蛋白质或脂质附加糖类的复杂生物过程，作为对蛋白质的一种重要修饰作用，糖基化具有调节蛋白质的功能并有助于蛋白质的折叠。

核苷酸糖是糖类转换与合成过程中的一种活化形式，广泛存在于真核生物及原核生物中，其在聚糖合成中作为糖基供体，对生物体生理功能的运行乃至生存至关重要。在结构上，核苷酸糖可分为核苷一磷酸（NMP）-糖和核苷二磷酸（NDP）-糖，其中NDP-糖是较常见的核苷酸糖，而尿苷二磷酸（UDP）-糖是最常见的核苷酸糖供体，其通过聚糖生物合成途径中的糖基转移酶或合成酶转移到糖基受体上构建糖苷键。

围绕核苷酸糖的生物合成，美国加州大学伯克利分校Jay Keasling教授实验室通过对酿酒酵母进行工程化设计改造，使其异源表达核苷酸糖合成酶，从简单起始底物（比如葡萄糖、半乳糖等）中获得了多种类型的 UDP-糖，为今后生产各种糖基化新天然产物和蛋白质提供了一个新生物合成平台。

目前，这项研究成果已经以“Engineered Saccharomyces cerevisiae as a Biosynthetic Platform of Nucleotide Sugars”为题发表在ACS Synthetic Biology上。

▲图｜（来源：ACS Synthetic Biology）

糖基化是蛋白质、脂质和天然产物中普遍存在的修饰，这些分子上的糖可以极大地改变其生物活性和稳定性。如今，业界围绕糖基化的化学研究已经开始探索糖缀合物的合成空间以及糖在生物学中发挥的生理作用。

在自然界中，糖基化过程糖的添加是通过高度特异性的糖基转移酶来实现的，其中，NDP-糖是 90% 以上糖基化反应的单体底物，为天然多糖和糖缀合物的重要组成部分。开发新生物合成途径来更加简单地生产核苷酸糖将会大幅加速表征新的糖基化反应、阐明其潜在调控机制以及生产糖基化分子。

▲图｜UDP-D-Glc 和 UDP-D-Gal 天然核苷酸糖的生物合成（来源：ACS Synthetic Biology）

核苷酸糖可以从头合成，这个过程涉及核苷酸糖合成酶，这些酶提供了一个生物合成网络，通过氧化、脱羧、异构化等反应，将现有的核苷酸糖相互转化为多种结构的 NDP-糖单体。

作为一种模式微生物，酵母具有遗传易操作性和可放大性，能够表达复杂天然产物的整个生物合成途径，以及生产新天然产物等，常被用于在体内研究新酶的功能。在这项研究中，Jay Keasling和团队选择酵母作为生物合成平台底盘来构建这种酶网络。

酵母自身能够产生 UDP-D-葡萄糖（UDP-D-Glc）和 UDP-D-半乳糖（UDP-D-Gal），通过表达相应的异源核苷酸糖合成酶，这些 UDP-糖底物可以转化为其他 UDP-糖。

在这项研究中，他们证明了植物和微生物来源的核苷酸糖合成酶可以在工程酿酒酵母中单独表达和组合表达，进而能够获得各种类型的 UDP-糖。

具体而言，尿苷二磷酸-D-葡萄糖（UDP-D-Glc）可以利用核苷酸糖合成酶转化为尿苷二磷酸-D-葡萄糖醛酸（UDP-D-GlcA）、尿苷二磷酸-D-木糖（UDP-D-Xyl）、尿苷二磷酸-D-芹糖（UDP-D-Api）、尿苷二磷酸-D-岩藻糖（UDP-D-Fuc）、尿苷二磷酸-L-鼠李糖（UDP-L-Rha）、尿苷二磷酸-L-阿拉伯吡喃糖（UDP-L-Arap）和尿苷二磷酸-L-阿拉伯呋喃糖（UDP-L-Araf）。

▲图｜UDP-D-GlcA、UDP-D-Xyl、UDP-L-Rha 和 UDP-D-Fuc 的生物合成（来源：ACS Synthetic Biology）

值得注意的是，各种类型 UDP-糖的相互转化由某些核苷酸糖进行变构调控，比如，下游产物 UDP-D-Xyl 对 UDP-D-Glc 6-脱氢酶（UGD）的强烈抑制作用。

为了克服抑制作用，并更好地调控 UDP-D-GlcA 和 UDP-D-Xyl 的细胞内水平，他们探索了多种策略，通过生成 UGD 突变体、筛选功能同源物以及正交诱导系统（Tet-On）来延缓 UDP-D-Xyl 的产生，以维持上游 UDP-糖的生产和积累，从而规避了这种抑制作用，使 UDP-D-GlcA 和 UDP-D-Xyl 都能在酵母中积累。

除了从头合成，核苷酸糖的另一种合成策略是通过补救途径，这个过程中游离糖被激酶激活产生糖-1-磷酸，然后被 NDP 焦磷酸化酶转化为 NDP-糖。在这项研究中，Jay Keasling和团队表达了编码补救途径的基因以直接激活游离糖，从而实现 UDP-l-Arap 和 UDP-l-Alaf 的生物合成。

此外，他们基于这种含有产生多种非天然 UDP-糖的生物合成途径的工程酵母菌株进行了一项时间过程研究，以分析这些糖的时间依赖性相互转化和 UDP-D-Xyl 在调控 UDP-糖代谢中的作用。在诱导后 48 小时的过程中，他们观察到 UDP-D-Xyl 在调控 UDP-糖合成中的作用，以维持细胞内 UDP-D-Glc 的高浓度。

试验结果显示，酵母中UDP-糖的浓度范围在 62 μM-3.4 mM之间，核苷酸糖的高浓度可用于细胞内糖基化。该研究团队表示，接下来可通过检测不同的核苷酸糖酶同源物或通过增加 UDP-D-Glc 的天然库来进一步提高核苷酸糖的浓度。

▲图｜工程酵母中 UDP-糖的生物合成途径示意（来源：ACS Synthetic Biology）

总的来说，这项研究通过利用其天然的 UDP-D-Glc 和 UDP-D-Gal 代谢，以及植物和微生物核苷酸糖合成酶，将酿酒酵母改造成了一个UDP-糖的生物合成平台，除了酵母自身具有的 UDP-D-Glc 和 UDP-D-Gal 之外，他们通过从头途径和补救途径合成了七种异源 UDP-糖（包括 UDP-D-GlcA、UDP-D-Xyl、UDP-D-Api、UDP-L-Rha、UDP-D-Fuc、UDP-L-Arap 和 UDP-L-Araf），大幅增加了 UDP-糖的可及性和可用性。

除此之外，基于该生物合成平台，可以在体内对糖合成酶进行功能表征，还可以检测细胞内 UDP-糖相互转化的调控以及产生糖基化的次级代谢产物和蛋白质，有助于深入理解生物合成、调控以及糖基化生物分子在生物学中所发挥的生理作用。

▲图｜加州大学伯克利分校化学与生物分子工程系教授 Jay Keasling（来源：UC Berkeley College of Chemistry）

这篇论文的共同通讯作者Jay Keasling是美国加州大学伯克利分校化学与生物分子工程系教授、劳伦斯伯克利国家实验室高级科学家，他实验室的研究方向主要围绕微生物的代谢工程领域，目前，他和团队已经开发出多种调节细胞内代谢途径的新工具，产生非天然分子的新代谢途径，以及在各种工业条件下生产化合物的新微生物宿主，并利用这些工具解决全球面临的重大问题，生产各种高值化合物（比如抗疟药物青蒿素）、特殊化合物，以及生物燃料等。

该论文共同通讯作者 Yuzhong Liu 此前曾在Jay Keasling实验室从事博士后研究，去年 5 月，她加入美国斯克利普斯研究所担任化学系助理教授，专注于利用合成生物学技术为疫苗佐剂和治疗剂开发新型小分子化合物。

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