Introduction

肝癌是一种发生在肝脏的恶性肿瘤，具有复发率高、侵袭性强等特点，其死亡率极高。肝癌面临的两个主要问题是早期诊断困难和预后性不佳，缺乏特异性靶点。肝癌主要包括肝细胞癌、肝内胆管癌、混合肝细胞胆管癌和纤维板层型肝细胞癌等。目前肝癌的临床治疗方法主要有手术治疗、化学治疗、免疫治疗等，手术切除是治疗HCC患者的主要治疗方式，但术后复发率仍较高。因此寻找高效、低毒的抗肿瘤药物并阐明其机制具有重要意义。

越来越多的研究表明，低毒、副作用小的天然产物是生物活性物质的主要来源。蛹虫草（Cordyceps militaris Link）是一种食药用真菌，具有抗血管生成、抗肿瘤、抗炎和降糖等活性。虫草素是蛹虫草中的主要活性成分，具有抗癌、抗病毒和免疫调节等活性。尽管虫草素对HepG-2细胞的细胞毒性作用已被证明，但其具体作用机制尚未完全阐明。Hippo信号通路能够调节细胞存活、增殖和分化并抑制肿瘤生长，信号通路发生异常可能会导致肿瘤异常生长。Hippo信号通路的核心是由一系列MST1/2、SAV1、MOB1和LATS1/2等激酶构成的级联反应。本研究通过转录组分析发现，虫草素可能通过调控Hippo信号通路进而发挥抗肝癌的作用，进一步筛选与Hippo信号通路相关的潜在关键基因，并确定基因表达的改变，以探究虫草素抗肝癌的作用机制。

Results

虫草素抑制HepG-2细胞增殖能力

经MTT实验和平板克隆实验发现，虫草素可以显著抑制HepG-2细胞的活力和增殖能力，且具有浓度梯度依赖性。根据细胞毒性曲线，确定虫草素对HepG-2细胞的IC50值为149.892 μmol/L。后续研究选用的虫草素浓度为150 μmol/L。

虫草素诱导HepG-2细胞凋亡

Hoechst 33258是一种核复染剂，它与DNA结合时在荧光显微镜下会发出蓝色荧光。如图2A，对照组中的细胞核呈现均匀的蓝色荧光，而虫草素组的细胞核出现致密、明亮的荧光染色质，典型的凋亡特性。在凋亡相关蛋白中，虫草素上调Bax和Caspase 3，下调Bcl-2蛋白水平的表达，且呈剂量依赖性。这些研究表明，虫草素以浓度梯度依赖性方式促进HepG-2细胞发生凋亡。

虫草素抑制HepG-2细胞的迁移能力

肝癌具有较强的侵袭性迁移能力，通过划痕愈合实验结果显示，与对照组相比，各处理组中HepG-2细胞的迁移受到抑制，且处理组与对照组相比，各组细胞迁移率具有极显著差异（P＜0.01）（图3），表明虫草素可抑制HepG-2细胞的运动性，并显著抑制细胞迁移能力。

差异基因富集在Hippo信号通路

通过转录组测序发现共有403个差异基因，与对照组相比，虫草素组有228个上调基因和175个下调基因（图4A）。通过GO功能分析发现，GO生物过程中含有与细胞凋亡（标红）、增殖（标蓝）、迁移（标黑）相关的Term（图4B），这与上述研究结果一致。经KEGG富集分析发现，Hippo signaling pathway是p值最小的信号通路（图4C），表明该通路可能在虫草素治疗肝癌中发挥重要作用。我们将所有的差异基因与Hippo信号通路相关的基因做富集分析，发现共有46个交集基因。热图分析发现，虫草素组和对照组的差异基因与Hippo信号通路相关的基因交集中有26个下调基因，20个上调基因。对照组和虫草素组各有1个高表达聚类区域和1个低表达聚类区域模块，对照组和虫草素组有部分基因的转录发生了巨大的逆转变化（图4D）。

Hippo信号通路关键因子的临床意义

YAP1是Hippo信号通路的重要基因之一，由PPI图可知YAP1与46个交集基因紧密互作（图5A）。通过GEPIA2数据库分析发现，YAP1和GBP3在肝癌组织中高表达，而MST1在肝癌组织中低表达（图5B），MST1低表达的患者预后更差（图5C）。研究还发现，ETV5、GBP3、GPCR5A和FOSL1可能也在虫草素抗肝癌中发挥重要作用（图5C）。其中GBP3和ETV5可能是虫草素调控Hippo信号通路的重要效应因子。

虫草素抑制HepG-2细胞中YAP1转录和Hippo信号通路成分表达

通过Western blot检测发现，虫草素在HepG-2细胞中时间依赖性和梯度依赖性抑制转录因子YAP1的表达（图6A-D）。此外，通过免疫荧光检测发现虫草素时间依赖性地抑制了YAP1向HepG-2细胞核的易位，表明虫草素会抑制YAP1在HepG-2细胞中的转录活性（图6E）。虫草素还会显著上调MST1、E-cadherin蛋白的表达；下调TGF-β1、GBP3、ETV5等蛋白的表达水平（图6F和6G），呈剂量依赖性。

抑制YAP1对虫草素抗HepG-2细胞的影响

YAP1是Hippo信号通路的关键因子，通过抑制YAP1进一步验证Hippo信号通路在虫草素抗肝癌中的作用，结果表明虫草素可能调控Hippo信号通路相关基因抑制细胞增殖和迁移能力而发挥抗癌作用，通过激活HepG-2细胞内Hippo信号通路诱导细胞凋亡。

虫草素抑制裸鼠移植瘤生长并诱导凋亡

虫草素治疗组肿瘤体积减少，与对照组相比具有极显著差异（P＜0.01），研究表明虫草素可以抑制移植瘤生长。经免疫组化检测可知，虫草素可以上调肿瘤组织中Caspase 3的表达，下调肿瘤组织中的YAP1和Bcl-2的表达，虫草素可能通过调控Hippo信号通路诱导肝癌移植瘤发生凋亡，从而抑制其生长。

图8 虫草素激活Hippo信号通路抑制HepG-2移植瘤生长

Conclusion

总之，本研究确定了虫草素作为一种天然产物可以在体内外诱导肝癌发生细胞凋亡。虫草素可能通过促进HepG-2细胞的MST1和LAST1的表达进而抑制YAP1的表达，通过调控Hippo信号通路调控GBP3和ETV5的表达，从而抑制HepG-2肝癌的细胞增殖、迁移；同时虫草素通过Hippo信号通路调控Bax和Bcl-2的表达，激活线粒体凋亡途径，细胞色素c释放到胞外后激活Caspase 3，最终促使细胞发生凋亡。

图9 虫草素通过调控Hippo信号通路发挥抗肝癌的潜在作用机制

第一作者

李晓敏，女，福建农林大学生命科学学院硕士研究生，生物学专业。研究方向为桑黄、蛹虫草等食药用菌活性物质的生物学效应评价及药理机制研究。

通信作者

傅俊生，博士，副教授，博士生导师；福建省级高层次人才、福建农林大学金山学者青年学术新秀；福建省食用菌产业技术创新联盟副秘书长；主要从事食用菌领域的教学与科学研究工作，致力于解析食用菌营养与人类健康关系，重点开展蛹虫草保健功能物质基础研究，挖掘其活性成分虫草素的抗癌分子转导机制，获国家自然科学基金资助（81503187）；近几年来，主持国家级、省部级、横向课题等项目10个；以第一作者或通讯作者发表SCI论文22篇（1区14篇、Top16篇）和中文论文46篇；主持省地方标准1项；第一发明人授权发明专利5项，其中3项专利权获得转让；第一完成人获得食用菌新品种1个，其品种使用权已转让并推广使用。

Mechanism of action of cordycepin in the treatment of hepatocellular carcinoma via regulation of the Hippo signaling pathway

Xiaomin Li,, Qing Liu, Songyu Xie, Xiaoping Wu, Junsheng Fu*

College of Life Sciences, Mycological Research Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

*Corresponding author.

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the common most malignant tumors. This study aimed to determine the in vitro and in vivo anticancer activity of cordycepin and elucidate its mechanism of action. The results of in vitro and in vivo studies revealed that cordycepin inhibited proliferation and migration in HepG-2 cells and inhibited the growth of HepG-2 xenograft-bearing nude mice by inducing apoptosis. Transcriptome sequencing analysis revealed a total of 403 differential genes, which revealed that cordycepin may play an anti-HCC role by regulating Hippo signaling pathway. The regulatory effects of cordycepin on the Hippo signaling pathway was further investigated using a YAP1 inhibitor. The results demonstrated that cordycepin upregulated the expression of MST1 and LAST1, and subsequently inhibited YAP1, which activated the Hippo signaling pathway. This in turn downregulated the expression of GBP3 and ETV5, and subsequently inhibited cell proliferation and migration. Additionally, YAP1 regulated the expression of Bax and Bcl-2, regulated the mitochondrial apoptotic pathway, and induced apoptosis by upregulating the expression of the caspase-3 protein. In summary, this study reveals that cordycepin exerts its anti-hepatocarcinoma effect through regulating Hippo signaling pathway, and GBP3 and ETV5 may be potential therapeutic targets for hepatocarcinoma.

Reference:

LI X M, LIU Q, XIE S Y, et al. Mechanism of action of cordycepin in the treatment of hepatocellular carcinoma via regulation of the Hippo signaling pathway[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(2): 1040-1054. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250090.

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