鲜食葡萄无核化研究进展
孙艳等
基金项目：河北省农林科学院基本科研业务费项目（2023020103，2023020101）河北省农林科学院科技创新专项课题（2022KJCXZX-CGS-1）；热杂果现代种业科技创新团队（21326310D）
葡萄作为我国重要的经济作物，营养价值丰富，深受广大消费者的喜爱，除大量用于鲜食外，还用于酿酒、制干和制汁等。据联合国粮食和农业组织（FAO）统计，2020年中国葡萄产量超1484万 t，种植面积达77万 hm 2 ，分别位居世界第1位和第2位。随着我国经济水平的不断提高，消费者对葡萄品质和口感有了更高的要求，无核和大粒葡萄成为我国鲜食葡萄生产和消费的总趋势 。然而，我国现有无核葡萄品种较少，大多粒小，难以迎合广大消费者的需求。利用植物生长调节剂诱导有核葡萄种子败育并进行膨果处理成为生产优质、大粒、无核葡萄的重要途径。鲜食葡萄无核化栽培技术在生产上得到了广泛的应用 。本文综述了葡萄无核化机理、常用植物生长调节剂种类及其处理方法、无核化栽培技术及注意事项等，以期为大粒、无核鲜食葡萄的生产提供理论依据和参考。
1 国内外葡萄无核化研究进展
早在1957年，美国加州大学戴维斯分校的Weaver等将赤霉素（GA 3 ）应用于‘黑科林斯’和‘汤普森无核’葡萄后发现GA 3 能促进果粒增大 。1958年，日本研究人员发现GA 3 可以使‘玫瑰露’葡萄形成无核果实 ，随后GA 3 无核诱导‘蓓蕾A’获得成功并在生产上大面积推广应用。到20世纪80年代，四倍体葡萄‘先锋’和‘巨峰’无核化技术先后获得成功并应用于生产。近些年来，日本针对葡萄的无核化研究主要集中在‘安云皇后’‘翠峰’等四倍体葡萄上，部分无核技术已应用于生产 。链霉素（SM）对葡萄无核化技术的发展也具有重要的促进作用。1976年在广岛果树试验场偶然发现，SM能够导致葡萄无籽。之后，研究人员将不同抗生素用于诱导葡萄无核，发现SM与GA混合处理效果最好，其次是SM单独处理，再次是金霉素单独处理，并推测金霉素、SM可能对葡萄的生殖细胞有一定影响，使正常细胞合成受阻，从而导致无籽葡萄的形成 。1982年，小笠原等 研究指出，‘蓓蕾A’葡萄生产无核果实适宜的SM浓度为200～400 mg·L -1 。目前，GA和SM诱导葡萄无核结实技术已在日本得到广泛应用并推广至世界各地 。20世纪50年代，我国开始研究葡萄无核化技术。
罗国光等 于1959—1962年间对‘玫瑰香’葡萄施用GA后形成大量无核果实，然而大小果现象严重，有些果实发育不良；1962年在‘无核白’葡萄生长始期使用200 mg·L -1 GA 3 ，虽促进了果粒增大，产量有所增加，果实风味却变得淡而酸，相关研究结果在生产上均未得到推广 。20世纪80年代，齐与枢等 对‘白玉’葡萄进行了无核化研究，由于出现穗轴硬化、落花落果严重等现象未能大面积推广。20世纪90年代，李世诚、杨承时等 分别在‘先锋’和‘马奶子’葡萄上进行无核化研究，无核率和坐果情况良好且效果稳定。此后，我国关于葡萄无核化的试验与研究广泛展开，并取得了良好效果 。
2 葡萄无核化机理
子房不经过受精作用而形成无籽果实的现象称为单性结实。单性结实可分为天然单性结实和诱导单性结实两种类型。利用植物生长调节剂对葡萄进行无核化处理属于诱导单性结实，相关机制复杂，研究人员对其进行了探索，并取得了一定成果。
GA是诱导葡萄单性结实的主要植物生长调节剂之一，相关的生理学机制研究已较为充分，包括：
（1）外源GA 3 处理引起子房内包括IAA、CTK、SA、ABA、乙烯和多胺等多激素的相互作用导致胚败育；
（2）外源GA 3 诱导种子内活性氧积累引起细胞损伤增加，导致种子败育；
（3）外源GA 3 处理干扰了种子内氧化还原稳态，从而影响花粉活力和胚囊发育 。然而，GA诱导葡萄单性结实的分子作用机制尚不明确。近年来，研究人员发现miRNA通过影响花和种子的发育在GA诱导有核葡萄单性结实过程中发挥了重要作用。VvmiR159c对GA的响应是通过介导其靶基因 VvGAMYB 的表达调节花序的发育 ，最终导致了葡萄的单性结实。王霏等 指出，GA通过诱导VvmiR164a/c/d负调控靶基因 VvNAC 100使‘温克’葡萄单性结实。Zhang等 发现，VvmiR160a/b/c负调控 VvARF 10/16/17靶基因的表达在GA诱导‘白罗莎里奥’无核过程中发挥了关键作用。并且在VvimiR160家族中，VvimiR160a/b/c/d/e均介导 VvARF 18参与调控GA诱导葡萄种子败育的过程，其中VvimiR160a/b起主要作用 。GA 3 还通过促进种子中VvMIR3633a对 VvGA 3 ox 2的负调控作用，从而促进SOD酶相关基因、CAT酶相关基因以及 VvGA 3 ox 2亚族基因表达，并抑制 VvMnSOD 以及 VvGA 20 ox 2表达，进而抑制SOD、CAT酶活性并降低GA 3 含量，最终导致葡萄单性结实 。有学者还探索了VvmiRNA介导的葡萄种子硬化发育阶段的分子机制。VvmiRNA通过负调控木质素合成相关靶基因的表达来抑制葡萄核木质素的合成，从而在GA抑制葡萄种子硬化进而诱导果实无核过程中发挥关键作用 。此外，DELLA蛋白基因在葡萄GA信号传导及无核果实发育过程中也发挥了重要作用。VvDELLA将GA信号通路与生长素信号通路相结合，GA通过VvDELLA降低生长素/吲哚-3-乙酸转录因子（ VvIAA 9）和生长素响应因子（ VvARF 7）的表达，从而诱导葡萄孤雌生殖 。GA通过负调控3个DELLA蛋白基因（ VvGAI 1、 VvRGA和 VvSLR 1）来调控葡萄无核果实的发育 。
有学者研究了其他调节剂诱导葡萄无核化的机制。Lu等 发现，6-BA和4-CPA均能诱导‘峰后’葡萄无核，但果实内部形态却有较大差异。6-BA处理后胚珠生长受到抑制，而4-CPA处理后果实中形成假胚，两者诱导的单性结实与内源活性GA含量升高有关。Liu等 对4-CPA导致‘峰后’产生假胚的原因进行了深入研究，推测由于4-CPA使珠被发育相关基因VvARF 2发生了上调，抑制 VvAP 2基因的表达，从而加速了珠被的细胞分裂和分化。施用SM导致雌蕊的胚珠和胚囊发育异常，是其诱导‘玫瑰香’无核结实的主要原因 。Osako等 对3个正常授粉受精的葡萄品种的雌蕊进行了组织学检查，结果表明，SM处理可能抑制了胚乳发育，导致胚乳和胚退化，产生了种子萎缩的浆果。
3 葡萄无核化处理的常用调节剂
3.1 细胞分裂素
CPPU（商品名：吡效隆、氯吡脲、脲动素、KT-30等）是一种生物活性很强的苯基脲类细胞分裂素，具有促进细胞分裂、分化和扩大，诱导单性结实、保花保果、促进果实生长等作用 。在葡萄生产上常与GA 3 配合使用，获得无核果实，并促进果实膨大。贺保国等 对‘巨峰’进行无核处理，仅用GA 3处理无核率为62%～76%，GA 3 添加CPPU处理无核率可提高21%～27%。史文婷等 发现，与单独应用GA 3相比，GA 3 和CPPU混合处理‘阳光玫瑰’的无核化效果更佳，粒质量和果实硬度也明显提高。李蕊等 使用不同配比的GA 3 和CPPU混合药剂处理‘夏黑’葡萄发现，各处理均显著拉长了花穗，促进了果实膨大，提高了果皮硬度，其中，以GA 3 和CPPU混合药剂处理效果最佳，单独使用CPPU效果较差，单独使用GA 3 效果最差。使用CPPU能在一定程度上改善葡萄果实品质，而浓度过高易导致果实可溶性固形物含量降低，着色缓慢不均匀，延迟成熟，果梗加粗严重，落粒严重，果实品质下降。
TDZ（商品名：噻苯隆、益果灵）是人工合成的一种脲类植物生长调节剂，具有生长素和细胞分裂素的双重作用 。TDZ能够使葡萄果粒明显增大，对果实内在品质也有一定影响。盛花后对‘蜜汁’和‘寒香蜜’葡萄使用TDZ发现，葡萄果粒均显著膨大，可溶性固形物和可滴定酸含量无明显变化，TDZ的膨大效果显著高于GA 。花后使用TDZ处理‘RecelUzümü’葡萄，穗质量和粒质量均明显增加，可溶性固形物、总酚和总花青苷含量及pH均明显降低 。孙贺等用TDZ处理‘茉莉香’葡萄，果粒膨大效果显著，酸度显著增加，可溶性固形物含量显著降低，果实成熟延迟。相关研究均表明，TDZ与GA 3 和CPPU相比，膨果效果更加显著，副作用也较弱 。低浓度TDZ能够促进果实膨大，过高浓度则易导致植物落叶，使果实膨大受到相对抑制，所以，TDZ使用浓度不宜过高，一般为CPPU的一半 。
6-BA是第一个人工合成的细胞分裂素，属于高效能植物生长调节剂，能促进细胞分裂和增大，促进坐果和果实生长。BA使无籽果粒比例增加并非由于失核效应增加，而是BA使单性结实的果粒或种子中途败育的果粒继续生长，并未促进有籽果变为无籽果 。‘里扎马特’施用30 mg·L -1 6-BA后，粒质量和可溶性固形物含量均显著增加，酒石酸和总酸含量显著降低，6-BA的施用影响了有机酸代谢相关基因的表达从而抑制了果实中有机酸的合成 。6-BA处理使‘2A’葡萄的粒质量、体积和硬度均增大，对可溶性固形物和可滴定酸含量均无明显影响 。花后施用低浓度的6-BA可以通过促进内源激素ABA、可溶性总糖含量以及相关基因表达量的增加来提高果实的花色苷含量 。在6-BA的使用浓度和时期不当时，易导致果穗扭曲变形、果实僵化、果粒变短、延迟成熟等 。
3.2 赤霉素
赤霉素（GA）自1938年被发现以来，在植物、真菌和细菌中已经鉴定了136个成员，以GA 1 到GA 136命名。而在植物产生的GA中，只有少数（如GA 1 、GA 3 、GA 4 和GA 7 ）具有生物活性，能够调节植物生长和发育 ，其中，GA 3 在葡萄无核化栽培中应用最早，且以GA 3 和GA 4+7 诱导单性结实效果最好。
花前和花期施用GA 3 能够拉长花序，诱导果实无核，花后施用GA 3 可以促进细胞膨大，使果粒变大。杨丽丽等 发现，‘阳光玫瑰’葡萄花序的伸长与GA 3 的施用浓度呈正相关，究其原因是由于外源GA 3间接抑制了内源GA 3 的合成，并抑制了 DELLA 基因的表达，从而促进了花序的伸长。赵佳等 在花前分别使用50、75、100 mg·L -1 GA 3 处理‘着色香’葡萄，果实无核率均达到100%，且当GA 3 浓度为75 mg·L -1 时，粒质量最大。盛花末期用25 mg·L -1 GA 3 并在12 d后再用50 mg·L -1 处理‘早黑宝’和‘晚黑宝’，可以使粒质量、果粒纵横径明显增加，果实成熟期提前，挥发性物质增加，商品价值提升 。王西平等 在不同时期用不同浓度GA 3 处理‘巨峰’‘藤稔’和‘京亚’葡萄，结果发现，各处理均促进了无籽果的形成且显著增加了粒质量，其中，‘巨峰’和‘京亚’均以花前80 mg·L -1 +花期40 mg·L -1 GA 3 处理无籽果率最高，分别为100%和82.3%，‘藤稔’则以花前80 mg·L -1 +花期80 mg·L -1 GA 3 处理无籽果率最高，为66.7%。可见，GA 3 处理时期和浓度不同，葡萄品种对GA 3 的敏感程度也不同。并且GA 3 的不当使用易导致严重落花落果，果梗硬化、加粗，果实商品性下降。
3.3 生长素
4-CPA（商品名为防落素、促生灵）具有促进生长、诱导单性结实等功能。单独使用时，不同品种间反应不同，‘玫瑰香’经处理后，果粒增大，酸度提高，对糖度无影响 ；而在‘峰后’上的试验发现，果粒变小，坐果率降低 。生产中将4-CPA、GA和SM混合使用，能够促进葡萄无核果形成，增加坐果率，促进果实成熟，抑制穗轴增粗 。
3.4 抗生素
目前生产中常将SM与GA 3 配合使用，除了能够显著提高葡萄果实的无核率外，还可以大大扩展GA 3 可诱导的时间范围，使无核处理可操作时间延长，并且可以减轻穗梗的硬化与木栓化，从而减弱GA 3 的副作用 。而对‘新郁’葡萄单独使用SM处理，得到的无核果实较小，果皮出现水渍状 。
4 葡萄无核化处理时期
葡萄无核化常常包括两次药剂处理，分别用于诱导果实无核和促进果实膨大。不同品种无核处理的适期大致分为3类：第一类首次处理常于盛花前10～14 d进行，处理适期3～4 d，第二次处理于花后10 d进行，品种多为‘玫瑰香’‘亚历山大’‘莎巴珍珠’等二倍体品种，种子较多，无核化较困难；第二类常于花前2～3 d或初花期实施第一次药剂处理，花后10～15 d实施第二次药剂处理，品种多具有较少的种子或较多的软核，如‘巨峰’‘白玉’‘黑奥林’等四倍体品种；第三类可于盛花末期进行第一次处理，花后10 d进行第二次处理，品种多具有一定自然单性结实特性，不使用药剂处理也可形成无核果实。各地研究结果稍有不同。第一次处理的适期对葡萄无核化至关重要，处理过早或过晚，均易导致较低的无核率。因此，需要通过准确判断花期来确定处理时间。日本学者总结了3种判断花期、推测葡萄无核化处理适期的方法：（1）根据花粉及胚珠的发育与GA 3 处理时期的关系判断花期来推测处理适期；（2）公式推测法：根据经验公式推测出开花始期，然后确定GA 3 的处理适期；（3）形态判断法：从植株生育状态和花器发育形态来衡量 。
5 药剂种类与浓度
目前葡萄无核与膨大两次处理均以GA 3 为主，但由于副作用较明显，生产中常通过添加6-BA、CPPU、TDZ、4-CPA等辅剂来减轻GA 3 的副作用。巨峰系葡萄无核化处理通常分两次进行，第一次处理GA 3 浓度为12.5～25 mg·L -1 ，第二次处理GA 3 浓度为25 mg·L -1 混加CPPU 2～5 mg·L -1 ，CPPU最高不能超过10 mg·L -1。SM 200 mg·L -1 单用或添加GA S 25 mg·L -1 的水溶液浸蘸花穗可以有效诱导欧亚种葡萄的无核结实 。
用浓度为100 mg·L -1 的GA 3 处理‘玫瑰露’和‘蓓蕾玫瑰A’无核化效果较好。‘阳光玫瑰’无核化处理多采用25 mg·L -1 GA 3 和1.25～5 mg·L -1 CPPU组合或GA 3 与3～5 mg·L -1 TDZ组合处理，膨大处理多用25～50 mg·L -1 GA 3 和2～5 mg·L -1 CPPU组合处理或25 mg·L -1 GA 3 单独处理 。应根据葡萄品种特性和生产需求确定辅剂种类、施用剂量和施用时期，从而提高葡萄果实无核率和综合品质。
6 药剂处理方法
关于葡萄无核化技术药剂的使用方法，浸蘸、喷施、涂抹等方式均可。生产上两次处理均以浸蘸为主，将花序或果穗完全浸没于药剂中，持续3～5 s，第二次处理为提高工作效率，可以喷施。处理完成后应轻轻晃落果穗上多余的药剂，防止积聚的药液浓缩后在果实表面产生药害。处理时间宜在晴天的清晨或傍晚，添加展着剂有助于药剂均匀附着于花序或者果穗。
7 无核化栽培技术
无核化栽培技术的成功，除了药剂的正确使用，品种、树体管理、花序和果穗管理等均会影响无核化效果，均需要引起重视。
7.1 品种选择
近年来，学者们已对多个葡萄品种的无核化技术进行了研究，虽然有些品种的无核率很高，但是或多或少会存在品质下降的问题。通常判断一个品种是否适合无核化栽培，综合标准应该是：（1）无核率应达到90%左右；（2）药剂对穗轴无副作用或作用极轻微；（3）无核化后果粒大小应与同品种的有核果相似；（4）无核化效果稳定，受环境、年份、栽培条件等影响较小。同时满足上述4个条件的品种才适合无核化栽培 。
7.2 园地选择及树体培养
进行无核化栽培的植株应选择地势较高、通风透光良好、土壤肥沃、排水和灌溉条件良好的园地进行定植。选择的植株应生长发育正常、树体健壮、上一年负载量合理，而遭遇过严重病虫害、树势较弱的树体，无核化效果较差。休眠期树体修剪应较常规栽培重一些，宜采用短梢修剪，从而使树体营养集中，促进来年新梢生长快而旺，长势整齐，能够在早期形成较大叶面积。代表性的短梢修剪树形是龙干式，如我国北方的独龙干式整枝，双臂水平式整枝，日本有一字形、H形整枝等 。
7.3 花果管理
同一花穗各部位发育程度不同，为保证果实发育一致，穗形美观，可适当去除花穗肩部和穗尖，此操作在花期结束前完成，从而避免营养浪费。无核化处理可能导致产量不稳定，需合理控制结果量。强、旺结果枝可留1～2穗果，中庸结果枝留1穗，细弱结果枝不留穗。无核化处理往往使坐果率提高，从而减少了各果粒的生长空间，造成各果粒相互挤压变形甚至破裂，也会使果穗上色困难，成熟期延迟，因此，对于果粒较多较密的果穗必须进行疏粒，畸形粒和小僵果均予以去除，一般在黄豆粒大小时进行，以‘阳光玫瑰’为例，每穗约留60～80个果粒。
8 葡萄无核化栽培注意事项与展望
（1）虽然目前市场上无核化药剂种类较多，但缺乏品种专用药剂。由于品种特性不同，对无核化药剂的敏感性不同，并且树势、花期、环境温湿度等均会对无核化效果产生影响，因此，使用无核化药剂前需先进行小面积试验，找到最适浓度和使用时期后再扩大使用面积，以免因为药剂使用不当，造成果实品质下降从而引起严重经济损失。
（2）无核药剂要规范使用，防止因为药剂浓度不适宜导致穗轴硬化弯曲、僵果，果实可溶性固形物含量下降、风味物质含量降低等。
（3）无核化栽培技术的成功除无核药剂的合理使用外，还要重视树体管理、水肥管理、病虫害防治等配套栽培措施的应用。
随着葡萄无核化相关研究日益增多，今后应加强完善无核药剂的登记许可制度，规范药剂的使用方法及配套栽培管理技术，明确适宜无核化的栽培标准，针对不同品种制定相应的无核化栽培技术，并加强示范推广工作。随着葡萄无核化栽培技术日益完善，优质、大粒、无核葡萄将会迎来规模化发展，市场前景也将更加广阔。
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