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导读

根据中医理论，胆汁淤积属于黄疸的范畴。茵陈蒿已广泛用于中医治疗黄疸。多糖是中草药的主要活性成分之一，但茵陈蒿多糖（APS）对胆汁淤积的作用尚不清楚。本研究探讨茵陈蒿多糖对胆汁淤积和肝损伤的保护作用及其机制。我们在α-萘异硫氰酸酯（ANIT）诱导的小鼠模型中评估APS对胆汁淤积的改善作用；然后使用核Nrf2敲除小鼠、质谱、16s rDNA测序、代谢组学和分子生物技术方法来阐明APS对抗胆汁淤积性肝损伤的相关机制。低剂量和高剂量APS治疗显著减少小鼠胆汁淤积性肝损伤。从机制上讲，APS促进肝核因子-红系2相关因子（Nrf2）的核转位，上调下游胆汁酸（BA）外排转运蛋白和解毒酶的表达，改善BA稳态，减轻氧化性肝损伤；然而，这些作用在Nrf2敲除小鼠中被消除。此外，APS改善了胆汁淤积小鼠的微生物群失调，并选择性地增加了产生短链脂肪酸（SCFA）的细菌的生长。APS的粪便微生物群移植也促进了肝脏Nrf2的活化，增加了BA外排转运蛋白和解毒酶的表达，改善了肝内BA的积聚和胆汁淤积性肝损伤。非靶向代谢组学和体外微生物群培养证实，APS显著增加了微生物群衍生的SCFA（丁酸）的产生，该SCFA也能够上调Nrf2的表达。这些发现表明，APS可以通过调节肠道微生物群和激活Nrf2途径来改善胆汁淤积。

论文ID

原名：Artemisia capillaris thunb. Polysaccharide alleviates cholestatic liver injury through gut microbiota modulation and Nrf2 signaling pathway activation in mice

译名：茵陈蒿多糖通过调节肠道菌群和激活Nrf2信号通路减轻小鼠胆汁淤积性肝损伤

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：5.4

发表时间：2024.3

通讯作者：吴家胜&马越鸣

通讯作者单位：上海中医药大学

实验设计

实验结果

1. 茵陈蒿多糖(APS)的化学性质

茵陈蒿中APS含量为3.4%。APS中总碳水化合物和糖醛酸含量分别为66.3 ± 2.0%和26.8 ± 1.6%。所得APS的平均分子量为59.1  kDa。APS中单糖的组成（图1A）包括阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖，其含量分别为49.18%、26.42%、9.75%、8.87%、307%和2.71%。3516.23 cm-1处的宽吸收峰是羟基O–H的伸缩振动峰，2918.30 cm-1附近的吸收峰是C–H的拉伸振动峰，这是糖的特征峰。1737 cm-1附近的吸收峰表明APS中存在糖醛酸（图1B）。APS的扫描电子显微照片图像如图1C所示。APS表面粗糙，具有不同尺寸的各种块状结构。进一步放大后，我们观察到表面不均匀，颗粒分布紊乱，结构复杂（图1C）。1H NMR谱信号在δ1.0–5.5ppm区域中积累 。δ5.15–5.0 ppm表示阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖的H1和甲基化葡萄糖醛酸的H5。δ4.395 ppm表示β-半乳糖H1，δ2.0–2.1 ppm可能是乙酰基上的甲基氢信号，δ1.16 ppm是H6上的甲基氢信号。13C NMR谱信号在δ61–173 ppm区域中积累。δ173.72 ppm为葡萄糖醛酸羧基碳，δ170.76 ppm是甲基化葡糖醛酸羧基碳。δ52.8 ppm是甲基化糖醛酸的酯甲基碳信号。δ20.5和20.2 ppm是乙酰基上的甲基碳（图S4）。

图1 茵陈蒿多糖（APS）的化学性质。（A）APS的单糖组成：鼠李糖（1）、岩藻糖（2）、阿拉伯糖（3）、木糖（4）、甘露糖（5）、葡萄糖（6）和半乳糖（7）。（B）APS的FT-IR光谱。（C）不同放大倍数APS的扫描电子显微照片。

2. APS改善ANIT诱导的小鼠胆汁淤积性肝损伤

如图2A所示，胆汁淤积症小鼠的血清生化指标显著升高，低剂量和高剂量APS显著降低血清生化指标。此外，胆汁淤积小鼠的肝损伤，包括中性粒细胞浸润和肝细胞坏死增加；然而，在APS处理后，它们减少了（图2B和C）。这些结果证实APS可以改善胆汁淤积性肝损伤。

图2 茵陈蒿多糖改善胆汁淤积小鼠的肝损伤。（A）各组小鼠血清碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)活性以及血清总胆汁酸(TBA)和总胆红素(TBIL)水平；（B）各组小鼠苏木精和伊红（H&E）染色中肝细胞坏死的定量分析；（C）H&E染色用于每组小鼠肝脏形态的光学显微镜分析。原始放大倍数×200；a：对照组；b1-b2：Vehicle +ANIT组；c：APS50+ANIT组；d：APS100+ANIT组；e：UDCA+ANIT组；数据表示为平均值±SEM。与Vehicle +ANIT组相比，*p＜0.05；** p＜0.01。

3. APS通过调节Nrf2通路改善胆汁淤滞小鼠BA稳态

结果显示，在Vehicle+ANIT组的胆汁淤积小鼠中，血清牛磺酸结合、甘氨酸结合的和未结合TBAs的水平显著升高；然而，在APS处理后它们减少（图3A和B）。类似地，胆汁淤积小鼠肝组织中的BA也增加，APS给药降低了牛磺酸结合BAs和TBAs（图3C和D）。为了探讨APS对BA稳态的作用机制，我们通过实时PCR检测BA摄取转运蛋白、外排转运蛋白、代谢酶和合成酶的表达。结果发现，APS对胆汁淤积小鼠肝组织Fxr、Pxr、Tgr5和Car的表达没有影响。然而，APS处理后，胆汁淤积小鼠肝组织中Nrf2和下游外排转运体Mrp2、Mrp3和Mrp4的mRNA表达显著上调（图4A）。如图4B和C所示，APS处理后，Nrf2肝蛋白在细胞核中的表达显著增加，在胞质溶胶中的表达减少。类似地，MRP2、MRP3和MRP4蛋白表达也被APS上调（图4D和E）。总体而言，APS上调Nrf2和下游外排转运体的表达，促进BA排泄，并减少BA在肝组织中的积聚。

图3 茵陈蒿多糖降低胆汁淤积小鼠的血清和肝脏胆汁酸。（A）小鼠单独胆汁酸的血清浓度。（B）小鼠牛磺酸结合、甘氨酸结合、非结合和总胆汁酸的血清浓度。（C）小鼠单独胆汁酸的肝脏浓度。（D）小鼠肝脏中牛磺酸结合、甘氨酸结合、非结合和总胆汁酸的浓度。数据以平均值 ± SEM表示。n=8；*p<0.05，**p < 0.01。

图4 茵陈蒿多糖增加胆汁淤积小鼠Nrf2、胆汁酸外排转运蛋白和抗氧化基因的表达。（A）通过实时PCR检测小鼠肝组织胆汁酸代谢酶、转运蛋白和核受体的mRNA表达；（B）通过蛋白质印迹检测小鼠肝组织的核和胞浆Nrf2蛋白表达；（C）Nrf2蛋白的定量密度分析。（D）通过蛋白质印迹检测小鼠肝组织中Mrps转运蛋白和HO-1、NQO1、GCLC和GCLM蛋白的表达；（E）MRP2、MRP3和MRP4蛋白表达的定量密度分析。（F）实时PCR检测小鼠肝组织中Ho-1、Nqo1、Gclc和Gclm的mRNA表达；（G）各组小鼠肝脏ROS水平；（H）HO-1、NQO1、GCLC和GCLM蛋白表达的定量密度分析。数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，与Vehicle+ANIT组相比。

4. APS增加Nrf2下游抗氧化基因表达并减少氧化性肝损伤

APS给药上调了胆汁淤积小鼠中肝脏Nrf2下游基因如Ho-1、Nqo-1和Gclc的mRNA表达（图4F）。此外，APS降低了胆汁淤积小鼠中活性氧自由基（ROS）的表达（图4G）。APS显著上调胆汁淤积小鼠肝组织中HO-1、NQO1、GCLC和GCLM蛋白的表达（图4D–H）。这些结果表明，APS可以诱导Nrf2下游抗氧化基因的表达，减少氧化性肝损伤。

5. APS对胆汁淤积性肝损伤的保护作用依赖于Nrf2的激活

在患有胆汁淤积的Nrf2敲除小鼠中，血清生化指标水平显著升高，但APS处理并未缓解（图5A）。此外，APS并没有改善患有胆汁淤积症的Nrf2敲除小鼠的肝细胞浸润和坏死（图5B和C）。这些结果证实APS对肝损伤的保护作用依赖于Nrf2的激活。

图5 在Nrf2敲除小鼠中，APS对胆汁淤积性肝损伤的保护活性消失。（A）血清生化参数。（B）各组小鼠肝细胞坏死的定量分析；（C）肝损伤的组织学观察(×200)。数据以平均值±SEM表示。n=6–8；与Vehicle+ANIT（Nrf2+/+）组相比，#p<0.05，##p<0.01。与Vehicle+ANIT（Nrf2-/-）组相比，*p<0.05，**p<0.01。

6. APS对BA稳态和氧化性肝损伤的保护作用依赖于Nrf2的激活

Vehicle+ANIT组中胆汁淤积小鼠（Nrf2−/−）的牛磺酸结合、甘氨酸结合和非结合BA的血清和肝组织水平显著升高，而APS没有降低（图6A–D）。此外，在胆汁淤积的Nrf2敲除小鼠中，APS对肝组织中Mrp2、Mrp3和Mrp4的mRNA和蛋白表达的上调作用被消除（图6E–F，H）。此外，在胆汁淤积的Nrf2敲除小鼠中，APS没有增加肝脏Nrf2下游抗氧化基因的表达（图6H–J）。APS没有降低胆汁淤积的Nrf2敲除小鼠的肝脏ROS水平（图6G）。这些结果证实APS对BA稳态和胆汁淤积性氧化损伤的影响依赖于Nrf2途径。

图6 在胆汁淤积的Nrf2敲除小鼠中，APS改善的BAs稳态和氧化性肝损伤无效。（A）Nrf2敲除小鼠中单个BA的血清浓度。（B）Nrf2敲除小鼠中牛磺酸结合、甘氨酸结合、非结合和总BA的血清浓度。（C）Nrf2敲除小鼠单个BA的肝脏浓度。（D）Nrf2敲除小鼠中牛磺酸结合、甘氨酸结合、非结合和总BA的肝脏浓度。（E）MRP2、MRP3和MRP4蛋白的定量密度分析；（F）通过RT-PCR检测Nrf2敲除小鼠的肝组织中Mrp2、Mrp3和Mrp4 mRNA的表达；（G）各组小鼠肝脏ROS水平；（H）通过蛋白质印迹检测Nrf2敲除小鼠肝组织中MRP2、MRP3、MRP4、HO-1、NQO1、GCLC和GCLM蛋白的表达；（I）HO-1、NQO1、GCLC和GCLM蛋白的定量密度分析；（J）Ho-1、Nqo1、Gclc和Gclm在Nrf2敲除小鼠肝组织中的mRNA表达。数据表示为平均值±SEM。与Vehicle+ANIT（Nrf2−/−）组相比，*p<0.05、**p<0.01。

7. APS缓解胆汁淤积小鼠肠道微生物群失调

肠道微生物群分析如图7所示。α多样性分析表明，Vehicle、ANIT和APS处理组之间的Sobs指数没有显著差异（图7A）。然而，β多样性分析的结果，如主坐标分析（PCA）和非度量多维标度分析（NMDS）所示，Vehicle、ANIT和APS处理组的微生物群组成存在显著差异（图7B-C）。我们使用维恩图对不同组（Vehicle、ANIT、APS）共享的操作分类单元（OTU）和OTU的平均数量进行可视化（图7D）。在门水平上，与Vehicle组相比，我们在ANIT组中观察到拟杆菌门和变形菌门的丰度增加，厚壁菌门的丰度降低，APS降低了变形菌门和厚壁菌门的丰度增加（图7E）。在科水平上，我们在ANIT组中观察到肠杆菌科的丰度增加，而毛螺菌科的丰度减少，APS给药也逆转了这些组成变化（图7F）。更重要的是，在属水平上，APS显著增加了胆汁淤积小鼠中产生SCFAs的细菌（如罗氏菌和乳杆菌）的数量，并减少了条件致病菌（如肠球菌）的数量（图7G）。这些结果表明APS改善了胆汁淤积小鼠的肠道微生物群失调。

图7 APS缓解胆汁淤积小鼠肠道微生物群失调。（A）Sobs指数；（B）各组肠道微生物群的主成分分析。（C）每组肠道微生物群的非度量多维标度（NMDS）分析。（D）不同组中OTU和重叠OTU的平均数量的维恩图。（E–G）不同组门、科和属水平上微生物群的相对丰度。

8. APS FMT减轻胆汁淤积性肝损伤

FMT的分组和治疗实验设计如图8A所示。胆汁淤积小鼠的血清生化指标与正常对照小鼠相比显著升高。从APS喂养的供体小鼠进行FMT后，胆汁淤积症小鼠的血清生化指标显著降低（图8B）。此外，肝脏组织学观察显示，FMT后胆汁淤积小鼠的炎症浸润和肝细胞坏死得到改善（图8C和D）。

图8 APS喂养小鼠的FMT减轻胆汁淤积受体小鼠的肝损伤。（A）FMT的分组和治疗实验设计。（B）血清生化参数。（C）各组小鼠肝细胞坏死的定量分析；（D）肝损伤的组织学观察( × 200)。数据以平均值 ± SEM表示。n = 8。与Vehicle+ANIT组相比，#p < 0.05，##p<0.01。与FMT_Vehicle+ANIT组相比，*p<0.05，**p<0.01。

9. APS的FMT改善BA稳态并减少氧化性肝损伤

与正常对照小鼠相比，胆汁淤积小鼠的血清和肝脏牛磺酸结合、甘氨酸结合和非结合的BA显著升高，并在APS喂养的供体小鼠FMT后降低（图9A–D）。此外，胆汁淤积受体小鼠肝组织中Mrp2和Mrp3的mRNA表达以及Mrp3和MRP4的蛋白表达在FMT后显著上调（图9E–G）。类似地，胆汁淤积小鼠的肝脏Nrf2mRNA表达在FMT后显著上调（图9H）。此外，FMT逆转了胆汁淤积小鼠细胞核中肝脏Nrf2蛋白表达的降低（图9J和M）。FMT后，肝脏Ho-1、Gclc、Nqo1和Gclm的mRNA和蛋白表达显著上调（图9G–K和L）。此外，FMT后肝脏ROS水平下降（图9I）。这些结果证实，通过APS处理改善BA稳态和减少氧化性肝损伤的Nrf2激活依赖于肠道微生物群。

图9 APS喂养小鼠的FMT激活受体胆汁淤积小鼠的Nrf2信号通路，降低胆汁酸水平和氧化性肝损伤。（A）FMT受体小鼠中单个BA的血清浓度。（B）FMT受体小鼠中牛磺酸结合、甘氨酸结合、非结合和BA总和的血清浓度。（C）FMT受体小鼠中单个BA的肝脏浓度。（D）FMT受体小鼠的牛磺酸结合、甘氨酸结合、非结合和BA总和的肝脏浓度。（E）通过实时PCR检测FMT受体小鼠肝组织中Mrp2、Mrp3和Mrp4 mRNA的表达；（F）MRP2、MRP3和MRP4蛋白的定量密度分析；（G）免疫印迹法检测FMT受体小鼠肝组织MRP2、MRP3、MRP4、HO-1、NQO1、GCLC和GCLM蛋白表达；（K）HO-1、NQO1、GCLC和GCLM蛋白的定量密度分析；（H）Nrf2在FMT受体小鼠肝组织中的mRNA表达；（J–M）FMT受体小鼠肝组织中Nrf2核蛋白和胞浆蛋白的表达；（I）FMT受体小鼠肝脏ROS水平；（L）Ho-1、Nqo1、Gclc和Gclm mRNA在FMT受体小鼠肝组织中的表达；数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。

10. 补充APS后，微生物群代谢产物丁酸增加，Nrf2表达上调

我们进行非靶向代谢组学测定APS给药后小鼠体内的代谢产物。OPLS-DA模型的结果显示，在Vehicle、Vehicle+ANIT和APS+ANIT组的小鼠中，代谢物簇显著分离（图10A）。受APS影响的24种代谢物如火山图和热图分析所示（图10B和C）。具体而言，与Vehicle+ANIT组相比，有6种代谢物上调，18种代谢物下调（图10B和C）。APS处理后，几种短链脂肪酸（SCFA）（如丁酸）的水平显著增加（图10D）。此外，我们还发现APS通过在体外与小鼠的肠道微生物群培养显著促进丁酸的产生（图10E）。为了验证丁酸对Nrf2的影响，我们用丁酸钠处理HepG2细胞系，其显著增加了细胞中Nrf2表达（图10F）。

图10 APS诱导的丁酸水平升高上调HepG2细胞中Nrf2的表达。（A）Vehicle、Vehicle+ANIT和Vehicle+ANIT、APS+ANIT组小鼠结肠内容物代谢组学特征的正交偏最小二乘判别分析。（B）APS干预后个体代谢产物变化的火山图（倍数变化>1.2或<-1.2，p<0.05）。（C）Vehicle、Vehicle+ANIT和APS+ANIT组小鼠结肠内容物中显著变化的代谢物的热图。学生t检验p<0.05的代谢产物被认为具有显著差异。（D）Vehicle、Vehicle+ANIT和APS+ANIT组小鼠结肠内容物中的丁酸浓度；两组间*p<0.05和**p<0.01；（E）APS通过体外与小鼠肠道微生物群培养，以剂量依赖的方式显著促进丁酸生长；（F）丁酸对HepG2细胞中Nrf2表达的影响；数据表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。

由于胆汁淤积性肝损伤的发病率高，治疗选择不足，因此有必要探索新的治疗方法。茵陈蒿是中医治疗黄疸的一种重要中药。ANIT常用于诱导小鼠胆汁淤积模型。在本研究中，我们研究了不同剂量APS对ANIT诱导的胆汁淤积的保护作用，结果证实APS可显著改善急性胆汁淤积和肝损伤。肝和循环BA积聚在胆汁淤积症患者中很常见。在PBC和PSC的发病机制中，肝脏中BAs水平显著升高，可导致肝脏损伤。在本研究中，APS上调肝脏Mrp2、Mrp3和Mrp4的表达，促进BA排泄，降低肝脏BA水平，表明APS可以改善BA稳态，改善胆汁淤积性肝损伤。

Nrf2是一种重要的核转录因子，可预防肝脏疾病。Nrf2的激活可以调节肝细胞下游抗氧化酶和外排转运体的表达，从而成为缓解急性和慢性肝损伤的药物靶点。在此，APS显著增加了胆汁淤积小鼠的Nrf2核转位，并促进了下游抗氧化酶和外排转运体的表达。此外，我们使用Nrf2敲除小鼠来验证Nrf2通路在APS活性中对肝损伤的关键作用。我们的研究结果表明，当Nrf2被敲除时，APS的保护作用消失。此外，APS对胆汁淤积的Nrf2敲除小鼠BA积累和氧化性肝损伤的缓解作用被消除。总的来说，APS对胆汁淤积性肝损伤的改善作用依赖于Nrf2。

由于草药多糖与肠道微生物群有相互作用，我们推测APS可能通过肠道微生物群或微生物群代谢产物激活Nrf2。我们的研究结果表明，APS在门水平上分别增加和减少了厚壁菌门和变形菌门的数量，并逆转了胆汁淤积小鼠的肠道微生物群失调。厚壁菌门是健康个体微生物群中丰富的有益细菌，可以作为健康和功能性微生物群的生物标志物。研究表明，变形杆菌丰度异常高是肠道微生物群失衡和肠上皮功能障碍的标志。有报道称，罗氏菌和乳杆菌是产生SCFA的细菌，与防止肝损伤显著相关。患有胆汁淤积症的婴儿体内有大量的肠球菌，这与PSC的严重程度呈正相关。在目前的研究中，APS显著增加了胆汁淤积小鼠的罗氏菌和乳杆菌的丰度，并促进了SCFAs的产生。APS还降低了胆汁淤积小鼠中肠球菌的丰度。因此，我们的研究结果表明，APS减轻了肠道微生物群的微生态失调。然而，APS富集的主要微生物群及其在改善胆汁淤积性肝损伤中的作用仍需在未来的工作中探索。APS富集的微生物群，如罗氏菌和乳杆菌对Nrf2途径的影响也需要在未来的工作中进行研究。

为了验证APS对肠道微生物群的影响，我们进行了FMT实验。APS和FMT增加了Nrf2通路的激活，上调了下游外排BA转运蛋白Mrps和解毒酶，减少了BA的积累和氧化应激，并改善了胆汁淤积性肝损伤。这些结果证实，肠道微生物群的调节在APS激活Nrf2中起着关键作用。微生物群代谢产物能够促进Nrf2的激活。

在本研究中，代谢组学用于检测APS给药后的微生物代谢产物水平。我们的研究结果显示，在患有胆汁淤积症的小鼠中，APS处理后，结肠中SCFAs（如丁酸）的浓度显著增加。此外，我们通过在体外培养APS和小鼠的肠道微生物群，发现APS以剂量依赖的方式显著促进丁酸的产生。据报道，丁酸可诱导HepG2细胞系中Nrf2的活化。在此，我们发现丁酸显著上调HepG2细胞中Nrf2的表达。APS增加了SCFA（丁酸）的产生，并进一步上调了Nrf2的表达。因此，调节肠道微生物-丁酸-Nrf2轴可能是APS改善胆汁淤积性肝损伤的关键机制。然而，丁酸在胆汁淤积性肝损伤中的作用需要在动物模型中进一步研究。此外，APS影响的丁酸产生菌/微生物群仍需进一步研究。APS是一种粗多糖，在本研究中尚未获得其化学结构。在未来，APS的进一步分离也是必不可少的。

总的来说，由于胆汁淤积性肝病的发病率高，治疗方案不足，探索新的治疗方案至关重要。肠道微生物群失衡是胆汁淤积性肝病进展的一个重要特征。在此，我们首次揭示了APS能够增加产生SCFAs的肠道微生物群，促进Nrf2通路的激活，从而改善胆汁淤积和肝损伤（图11）。

图11 APS治疗胆汁淤积性肝损伤的潜在分子机制

结论

APS可以通过调节微生物群和激活Nrf2来减轻胆汁淤积性肝损伤。我们的研究结果为中药多糖靶向肠道微生物群治疗胆汁淤积性肝病提供了新的证据。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38447617/

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