重要通告

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方法检索

往期实验方法，需要的老师可以按照以下操作进行查阅：进入公众号脑声常谈→底部菜单栏→脑声助手→方法检索→最上方搜索框输入实验名称，您找的实验方法就出来啦！

REM睡眠剥夺建模

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单平台睡眠剥夺方法

单平台睡眠剥夺方法将一个狭窄平台（直径6.5cm）放置在长40.0cm×宽34.0cm×高16.0cm的水槽中，往水槽中加水至平台下1.0cm。将1只大鼠置于狭窄平台上，当进入REM睡眠阶段时，动物会失去肌肉张力并接触水，从而觉醒。对照组通常是笼养对照动物或在完全相同的环境条件下将大鼠放置在宽平台上（直径14.0cm）。这种方法因为使动物受到了额外的不良刺激而广受争议，这些不良刺激可能会引起除实验目的以外的影响。例如，长期使用这种方法会导致动物下丘脑⁃垂体⁃肾上腺（HPA）轴的重度激活，并且会诱发应激反应和体温过度升高。

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多平台睡眠剥夺方法

为了减少单平台睡眠剥夺引起的应激反应，1981年vanHulzen和Coenen开发了多平台睡眠剥夺方法，即将1只动物放入一个包含7个平台的大水箱中，运动范围较单平台睡眠剥夺明显增大，从而消除单平台技术中的运动限制。尽管如此，仍存在许多与应激相关的改变，例如胸腺萎缩、体重减轻、肾上腺肥大和酪氨酸羟化酶活性增强等。

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改良多平台睡眠剥夺方法

为了减轻睡眠剥夺过程引起的社交隔离，多平台睡眠剥夺法被进一步改良发展为改良多平台睡眠剥夺法。该方法将来自同一个饲养笼中的10只大鼠放入装有14个狭窄平台的水箱中进行REM睡眠剥夺。其中，平台直径6.5cm，水箱长127.0cm×宽44.0cm×高45.0cm，水箱需将水加至平台下1.0cm，动物可以在水箱中自由活动并获取饮用水和食物。实验者需维持剥夺房间正常昼夜节律和温度，并且每天更换水箱中的水。改良多平台睡眠剥夺法最常使用大鼠和小鼠，其中SD大鼠、Wistar大鼠、ICR小鼠和c57BL/6J小鼠使用频率更高。小鼠常用的平台直径为3.0~3.5cm；平台与平台之间的间隔距离以动物能在平台间自由活动，但不能倚靠两个平台或水箱边缘入睡为宜，大鼠所在睡眠剥夺箱中的平台间距一般设置为7.0~10cm，小鼠则多设置为5.0cm。值得注意的是，在这个方法中同一个水箱中的实验对象需是来自同一个饲养笼中的动物。

完全睡眠剥夺建模

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强制运动

早期的完全睡眠剥夺通过电动驱动皮带不断旋转跑步机或跑轮，使动物不断运动而持续保持清醒。鉴于上述方法不能灵活地设置剥夺的模式，有团队开发了自动跑步机，可以周期性地使动物不断运动而达到睡眠剥夺的效果；他们将大鼠放置于58.0cm×40.0cm×10.0cm的跑步机上，跑步机的速度设置为10cm/s，工作周期设置为打开3s，关闭12s，以保证动物有足够的休息时间。在此基础上，有研究人员再次升级了这套装置，他们将脑电图和肌电图添加到自动装置中，当肌电图低于阈值时会触发跑轮运动，从而达到更精确的睡眠剥夺的效果。

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水平转盘睡眠剥夺法

实验装置由一个电脑控制台、一个水平转盘及两个开放的长方形有机玻璃缸组成。在实验前1周在大鼠头颈部植入微电极并提前适应1周，正式实验时将微电极与电脑控制台相连，当识别到动物进入睡眠阶段，控制器会激活转盘以3.5rev/min的速度旋转，直到大鼠被唤醒的时间超过6s。转盘的转动的方向是随机的，并且动物能自由地获取饮用水和食物。

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轻柔刺激法

轻柔刺激法在短期睡眠剥夺实验中应用较多，实验者通过温和的刺激干预动物睡眠，可有效减少90%~95%的NREM睡眠并消除REM睡眠。该方法在啮齿动物的饲养笼中进行，实验者通过观察或结合脑电图、肌电图在动物即将入睡时给予外部刺激（如：轻微的噪音、敲击笼子、轻轻摇晃笼子、用刷子尖轻触），使动物无法入睡；或者通过放入新物体和筑巢材料鼓励动物自发探索，从而达到睡眠剥夺的效果。这些轻柔的处理可以明显减少应激反应，也能避免过度运动，但是这种方法非常耗费人力。

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剥夺杆睡眠剥夺法

为了避免过度运动对剥夺结果产生影响，Ramesh等和Christie等开发了剥夺杆睡眠剥夺法，他们将动物放置于带有剥夺杆的装置内，该剥夺杆可以扫过笼子的底部，以迫使动物被轻推而醒来。在一些实验中，该剥夺装置可以按照设定好的时间表移动剥夺杆，而另一些实验则利用实时反馈的脑电图，仅在检测到特定睡眠阶段时移动剥夺杆，这种剥夺方法能成功有效地减少NREM睡眠并消除REM睡眠，同时最大限度地减少了动物的运动和压力。

- 睡眠剥夺仪，型号：XR-XS108 -

调控睡眠环路诱导睡眠剥夺

近些年来，不少研究人员在使用光遗传学或化学遗传学调控睡眠-觉醒神经环路诱导睡眠剥夺方面也取得了进展，这种调控睡眠环路诱导睡眠剥夺的方法主要是通过靶向特定受体来增加促觉醒中心的活性或降低促睡眠中心的活性来实现的，例如，刺激臂旁核或下丘脑乳头上核（促觉醒中心）中的神经元可以延长觉醒时间，而沉默腹外侧视前核或基底前脑（促睡眠中心）中的神经元可以减少睡眠。然而，睡眠和觉醒都是由多个协同工作的大脑区域控制，因此，仅选择性地调控一个大脑区域可能无法消除总体的睡眠。不过诸如此类的技术可以提供精确的时间和空间分辨率，根据所选目标研究特定睡眠阶段、神经元群或大脑结构的功能。更重要的是，应用此类方法通常不会引起动物应激反应的激活，因此，这提供了一种在没有压力作为混杂变量的情况下研究睡眠不足影响的方法。

疼痛诱导的睡眠剥夺

在目前已有的啮齿类动物病理性疼痛模型中，不少研究人员观察到疼痛状态下动物睡眠质量降低，睡眠结构发生改变。如将完全弗氏佐剂注射到大鼠后爪中可减少其总睡眠时间、增加NREM睡眠潜伏期、增加NREM发生次数、降低睡眠质量、增加总觉醒时间。在其他类型的关节炎大鼠模型中也存在清醒时间增加，总睡眠时间减少的改变。有实验结果表明，在慢性缩窄性损伤模型中出现持续的睡眠障碍，但这一实验结果在其他实验中并不稳定。此外，在术后疼痛模型中也观察到了慢波睡眠总时间减少和振幅下降。伤害性疼痛、神经病理性疼痛均能不同程度地引起睡眠障碍，不过这些疼痛模型和睡眠之间的相互作用还需要更多的研究。

电刺激睡眠剥夺法

该方法曾被认为是最接近于人类失眠的病理模型。其原理是以电流刺激动物足底，使其无法入睡，进而造成疼痛应激使动物无法进入睡眠。然而，因为个体对疼痛感存在差异，为了电极时让所有动物全部清醒，则需要对动物施加一定强度的刺激，如此便会产生应激。且外界电刺激会扰乱EEG及EMG信号，因此无法进行睡眠-觉醒周期的判断。

慢性束缚应激睡眠剥夺法

该方法的原理是将实验动物束缚在有限空间内，使其产生应激发应，进而造成应 激性睡眠剥夺模型。该方法可以从情绪角度探究睡眠剥夺机制，并可与其他方法结合进行复合束缚。但由于动物无法正常活动，除了情绪应激外，机体也会产生相应反应导致干扰因素产生。

慢性情绪应激睡眠剥夺法

该方法首先需要训练动物在规定时间进行饮水行为，实验阶段以无水水瓶刺激大鼠，使其产生负面情绪，进而使动物睡眠时间缩短。该方法更接近纯粹的心理应激，操作简单。但限制动物饮水会导致机体产生应激，影响实验结果。

行为检测

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旷场反应箱测试

用旷场反应箱测试大鼠行为的变化，将旷场反应箱放置在一个较封闭的屋内。旷场反应箱为一个底部面积为100cm×100cm，高30cm的方形容器，旷场正上方有一个摄像头监视大鼠活动，并可以将实验数据和图像信息输入计算机。观察大鼠在旷场反应箱中5min内的运动。静止总时间 (Total Still Time，TST)表示大鼠在旷场反应箱中5min内静止的总时间，运动总距离(Total Movemnet Distance，TMD) 表示大鼠在旷场反应箱中5min内运动的总距离。中心逗留时间(Center Stay Time，CET) 表示大鼠在旷场反应箱中5min内在内环的停留时间，角落逗留时间( Corner Stay Time，四角的停留时间。内环是指以旷场中心点为圆心，以10cm为半径的圆。

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学习记忆能力的测试

用Morris水迷宫进行大鼠学习记忆的训练与测试，其主要测试大鼠的空间学习记忆能力。水迷宫为一直径120cm、高50cm的圆形水池，池内水深25cm，水池按方位平均分为4个象限，设定4个入水点。在一个象限内置一个直径7cm、高23cm的白色平台，平台没于水面下2 cm。水温保持在20 ℃左右。实验过程中水池及周围环境保持不变。实验时，将大鼠面向池壁从4个入水点分别放入水池，用秒表记录大鼠的逃避潜伏期: 即从大鼠入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上所需时间(s)，大鼠找到平台后，让其在平台上站立10s。若入水后60s大鼠未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停留10s，然后进行下一次实验。将每只大鼠从4个入水点分别放入水池为1轮训练，1轮训练进行4次，训练2轮，共训练8次，每次60s，2次训练之间间隔30s。训练成功的标志是大鼠在60s内能够找到平台，淘汰训练未成功的大鼠。记录每只大鼠逃避潜伏期( Escape Latency，EL) 的时间。

- Morris水迷宫，型号：XR-XM101 -

参考文献

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5、Decreased alertness due to sleep loss increases pain sensitivity in mice.[J]. Alexandre Chloe;;Latremoliere Alban;;Ferreira Ashley;;Miracca Giulia;;Yamamoto Mihoko;;Scammell Thomas E;;Woolf Clifford J.Nature medicine,2017

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