通过单核RNA测序，研究人员付出了大量努力来揭示人类心脏的细胞异质性。然而，由于在检测转录因子方面存在的限制，心脏的转录调控网络尚未得到系统描述。

2024年4月22日，中国医学科学院/北京协和医院胡盛寿，宋江平和李向杰共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=39）在线发表题为”PBX/Knotted 1 homeobox-2 (PKNOX2) is a novel regulator of myocardial fibrosis“的研究论文，该研究优化了一个流程，用于分离细胞核并进行单核RNA测序，旨在检测更多的细胞信号基因和适量的转录因子。通过这个无偏见的方案，作者描述了健康人类心脏的细胞组成，并研究了决定主要心脏细胞亚型的细胞身份和功能的转录调控网络。特别是在成纤维细胞中，作者发现了一个新的调控因子，PKNOX2，与健康心脏中的生理性成纤维细胞活化相关联。为了验证这些转录因子在维持稳态中的作用，作者使用了针对成纤维细胞重塑的移植失败心脏的单核RNA测序分析。

轨迹分析表明，PKNOX2在成纤维细胞活化到病理性肌成纤维细胞形成过程中异常下降。体外的增加和减少功能实验表明了PKNOX2在病理性纤维化重塑中的抑制作用。此外，通过转位主动脉结扎手术诱导的心力衰竭小鼠模型中，成纤维细胞特异性的PKNOX2过表达和基因敲除显著改善和加重了心肌纤维化，分别。总之，这项研究建立了一个高质量的心肌单核RNA测序分析流程。通过这个优化的方案，作者描述了主要心脏细胞亚型的转录调控网络，并确定了PKNOX2作为抑制纤维化的新调控因子和未来转化研究的潜在治疗靶点。

心脏疾病显著地影响着全球公共健康负担，成为全球发病率和死亡率的主要原因之一。要实现先进的治疗策略，就需要深入了解人类心脏组成和分子调控机制。作为一个复杂的器官，心脏有四个形态和功能上明显不同的心房和心室，需要探索每种心脏细胞类型内独特的基因调控网络。这一探索对于阐明心血管疾病的发病机制至关重要，也是减轻心血管疾病负担的基本步骤。

准确描述人类心脏的细胞组成是必不可少的基础知识，对于理解心脏在发育、衰老和许多其他病理生理变化过程中发生的变化至关重要，也对于开发组织工程和器官样物方法至关重要。心脏的主要功能组成是心肌，其缺陷可以引起病理重塑，如心力衰竭，影响着全球数百万患者。已经有多次尝试来定义心脏中的细胞比例，但结果仍然存在争议。

心肌具有复杂的细胞结构，由心肌细胞（CMs）和非心肌细胞组成。CMs是泵血的主要功能细胞类型，但它们仅占心肌细胞的约30％。非心肌细胞组成了微环境，维持心肌的功能，并参与病理重塑过程，如心肌纤维化。尽管这些细胞不是心脏收缩的功能性细胞，但它们在维持心脏生理平衡中起着至关重要的作用，并且在心血管疾病领域的研究中越来越受到关注。

关于心脏非心肌细胞比例的共识较少，之前的研究使用传统的已知标记基因标记技术，其准确性和检测深度有限。长期以来，人们一直认为成纤维细胞是非心肌细胞中最大的细胞群体。然而，最近一项利用多标记流细胞分析的研究表明，内皮细胞占大多数非心肌细胞（64％）。需要进一步研究来澄清心脏细胞的确切组成。对于像心脏这样复杂和异质性的器官，其各种功能是由CMs和非心肌细胞共同调节的。当这种复杂的协调失调时，可能导致心脏的异常状态并导致疾病。因此，阐明正常和疾病心脏中的细胞异质性及其调节机制对于治疗与心脏相关的疾病至关重要。

单细胞转录组学已经彻底改变了我们对人类心脏细胞组成和相关基因表达的理解。新兴的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术已经被用于全面描述心脏发育、稳态和疾病。构建人类细胞图谱需要对来自不同样本的人类组织进行表达谱分析。然而，有三个主要障碍阻碍了这项技术在研究心脏组织中的广泛应用：难以分离CMs、应激诱导基因激活的伪迹、CMs的大尺寸不适合许多高通量scRNA-seq平台，最重要的是，一些CMs的多核现象。为了克服这些限制，大规模单核RNA测序（snRNA-seq）已被应用于揭示心肌细胞中的细胞异质性基因特征。

当前，各机构的核分离和测序方案存在差异，并且对心肌组织中测序质量、偏差和分辨率的系统评估过程，以及与scRNA-seq的比较尚未定义。更重要的是，由于处理心肌组织进行核分离的困难，现有核测序检测到的基因数并不理想，不如完整细胞分析检测到的那样。因此，以往的研究很少能够很好地描述调控心脏细胞亚型的转录调控网络，因为转录因子（TFs）的检测量较低。TFs是一类蛋白质，它们读取和解释DNA中的遗传“蓝图”，并结合到DNA上，帮助启动基因转录的增加或减少。因此，它们对心脏的许多重要细胞过程至关重要，如心肌纤维化、心脏节律紊乱、CMs凋亡等。通过高深度的sn RNA-seq检测TFs，可以更深入地了解正常心脏病理和生理状态。

研究流程图（图源自Signal Transduction and Targeted Therapy）

在本研究中，作者开发了一个稳健而无偏见的组织处理和单核转录组学分析流程，改进了检测更多TFs和参与信号通路的基因。通过这个优化的方案，作者描述了健康心脏的细胞组成，并确定了调控细胞亚型身份的转录调控网络。大量的TFs被确定为每种细胞类型的细胞识别和稳态维持的责任者，其中一个新的调节因子PKNOX2被证明在成纤维细胞激活期间具有抑制纤维化的潜力。体内研究证实了增强PKNOX2对缓解心肌纤维化和改善心功能的治疗效果。

中国医学科学院阜外医院陈亮、李昊桐和刘晓蕊为论文共同第一作者，胡盛寿院士、李向杰副研究员和宋江平教授为共同通讯作者。该工作得到国家自然科学基金青年项目、国家高水平医院临床研究基金和北京市科技新星计划项目资助。

参考消息：

https://doi.org/10.1038/s41392-024-01804-5