背景
双光子荧光显微镜因其可以对活体动物大面积细胞功能活动进行三维实时监测，且穿透性强，信噪比小，对活体组织损伤小而在越来越多的生命科学研究领域扮演着重要角色，得到广泛的应用。但由于显微镜镜头焦距短，仅能够检测活体小鼠大脑浅层的细胞，因此，目前利用荧光成像技术主要局限在在体观测实验动物的大脑颅顶皮层神经元。视交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)是哺乳动物最重要的昼夜节律起搏器，其调整着哺乳动物一系列生理行为和活动，目前探索SCN核团与周边核团的相互作用以及在昼夜节律、睡眠的调节机制是热点研究领域。通过颅底暴露手术暴露小鼠颅底核团，再联合运用双光子成像技术和荧光标记技术实现了对活体动物SCN神经元钙活动的实时记录。
手术准备
小鼠经戊巴比妥钠(10mg/kg)腹腔麻醉后，注射丁丙诺啡(1mg/kg)用于止痛。通过测试小鼠反射来监测评估麻醉深度，必要情况下可少量补麻醉药。将小鼠置于加热垫上，加热垫温度维持在36℃，用小鼠无创血氧仪监测小鼠手术过程中各项生理指标，包括体温、血氧饱和度和心率。将小鼠眼部涂上眼药膏保护眼睛，防止手术灯的强光刺激和干燥。接着给小鼠颅骨黏贴上起固定作用的钛合金金属片。手术过程如下:首先用75%酒精溶液消毒颅顶区域皮肤，用无菌手术刀片除去小鼠颅顶毛发;然后用镊子提起头皮用手术剪去除头皮暴露颅骨;再用棉球沾取少量双氧水轻轻擦拭颅骨以去除表层筋膜，用手术刀小心的刮去颅骨上粘连的剩余肌肉黏膜组织;将定制的钛合金金属片用502胶水先粘到头骨上，用力按压2min左右，待502胶水干透后，用牙科水泥将周边空隙填满。10min后待牙科水泥干透可继续下一步试验。
Fig1 颅顶粘贴钛合金金属片示意图
颅底暴露手术将手术电刀的中性电极板置于加热垫上，然后将麻醉小鼠仰卧位固定于中性电极板上。用弯头止血钳尖端紧贴于颌肌肉，把高频电刀尖端垂直贴于血管钳尖端，血管钳尖端沿虚线从上至下缓慢匀速凝烧灼表面血管。外科手术剪刀从两颗门牙中间剪一小口，再用高频电刀切开门牙。以上过程中，首选电切模式(输出功率15W)，但后续实验过程中若遇到小鼠血管流血，则改用电凝模式(输出功率20W)。在后续的手术过程中，由于很靠近颅底部位，因此要尽量减少对周围组织的损伤，需要选择一个相对低功率(输出功率是10W)的持续电流进行手术。用电刀去除颅骨表面的软腭，再用颅骨钻把颅底中线的腔隙磨至大小为2.5mm×5.0mm，将周边的颅骨磨薄至半透明状态，最后用镊子小心地从边缘掀开硬脑膜，清除腔隙中碎骨，直至视神经交叉及其下部的脑组织(主要是下丘脑)完全暴露。
将钙指示剂Oregon Green 488 BAPTA-1(OGB-1)用玻璃微电极(3～5MΩ)缓慢注入SCN区域，注射深度为150～350μm，容积为3μl，注射用时为5～10min，然后将定制玻片(2.5mm×5.0mm)覆盖在组织上，再用1.2%的琼脂糖压在玻片上，以尽量避免肌肉震颤和小鼠呼吸抖动造成的影响。
双光子在体成像
将完成颅底暴露手术并注射OGB-1染料的小鼠仰卧位固定于双光子显微镜下。用于拍摄的双光子显微镜包括扫描镜头(16x水镜，工作距离:3mm)和飞秒激光器。本实验中双光子激发光波长920nm，扫描频率为20.4Hz，图像大小为768×768个像素，连续扫描5000张，拍摄深度为－150～－350μm。将术后荧光标记的小鼠通过双光子荧光显微镜进行在体成像检测，成像深度为150～400μm，镜下能够清晰观察到颅底浅层血管、胶质细胞和SCN区域神经元。神经细胞聚集在一起并与血管形成一个密集的网络结构。
SCN区域神经元的自发钙信号
用双光子显微镜对SCN区域神经元进行荧光扫描和记录。将记录的扫描图片利用matlab软件随机选取出现自发反应的神经元，再通过Image J软件和Igor Pro 6软件分析并导出自发钙活动信号。
Fig2 颅底暴露手术全过程
文献引用
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