级联生物转化（或生物合成途径）通常由多种酶组成，用于目标分子的合成。这些生物催化途径分为自然存在的和人工构建的，可以通过酶共表达在体内重建，或与纯化的酶在体外重建以进行催化反应。目前，酶级联已被广泛用于合成各种有价值的化合物，如抗癌药物长春花碱、植物来源的医用托烷生物碱、实验性 HIV 药物伊拉曲韦，甚至 CO₂ 衍生的聚合淀粉。
然而，所构建的生物催化系统往往存在局限性，例如，基于细胞的系统可能受到代谢负担、酶的不溶性表达、底物运输效率低以及中间体/产物毒性的限制。纯化的酶通常存在纯化时间和成本、不稳定以及缺乏生物催化所需的辅助因子等问题。因此，需要设计一种方法，能够结合体内和体外系统的优势，同时避免或减少其缺点。
为了最大限度地利用活细胞或体外酶的力量，已采用如下三种方法：第一，通过酶与短柔性肽接头的融合、蛋白质支架上的酶组装或酶与共价肽相互作用的酶-酶连接（例如 SypTag/SpyCatcher 的肽/蛋白质对）来减少体内酶之间的空间距离；第二，利用酶固定化来增强酶稳定性和可重复使用性，常用于体外生物转化。第三，酶修饰，例如制造可用于在非常规介质（即有机溶剂）中催化的酶-聚合物结合物。
然而，在某些情况下，由于表达失败和/或酶表达不溶性，相关酶的表达和纯化无法在异源宿主细胞中实现，限制了目标酶在所需生物催化反应中的应用。
近日，在ACS Synthetic Biology期刊上发表了题为“An In Vitro Hybrid Biocatalytic System Enabled by a Combination of Surface-Displayed, Purified, and Cell-Free Expressed Enzymes”的研究论文，上海科技大学李健团队设计了一种能够整合活体全细胞、纯化酶和无细胞表达的优势的体外混合生物催化系统，通过组装三种酶，可以将苯乙烯转化为(S)-1-苯基-1,2-乙二醇。
具体来说，研究人员以不同的方式，即细胞表面展示、纯化和无细胞表达，制备了三种酶。为了组装它们，将两个正交的肽-蛋白质对（即 SpyTag/SpyCatcher 和 SnoopTag/SnoopCatcher）融合到这三种酶中，从而通过共价组装实现它们的空间组织。由此构建了一个多酶复合物，与未组装的自由浮动酶系统相比，它可以将 (S)-1-苯基-1,2-乙二醇的产量提高 3 倍。经过反应体系优化后，最终产物收率达到 234.6 μM，底物转化率为 46.9%（基于 0.5 mM 苯乙烯）。
研究人员首先使用两种荧光蛋白 sfGFP（超级折叠绿色荧光蛋白）和 mCherry 验证了自己的概念和设计。
最初用这两种蛋白质生成了三种构建体。构建体 1：sfGFP 的 N 端和 C 端分别与 LppOmpA 和 SpyTag 融合，产生表面展示构建体 LppOmpA-sfGFP-SpyTag。构建体 2：在 mCherry N 端和 C 端侧接 SpyCatcher 和 SnoopCatcher，获得构建体 SpyCatcher mCherry-SnoopCatcher。构建体 3：sfGFP与 N 端 SnoopTag 融合获得构建体 SnoopTag-sfGFP。
▲图丨使用 sfGFP 和 mCherry 构建三种蛋白质复合物（来源：ACS Synthetic Biology）
在构建体 1中，LppOmpA 是一种高效的展示系统，已成功用于在大肠杆菌表面展示多种蛋白质/酶，而 SpyTag 允许 sfGFP 与另一种与 SpyCatcher 融合的蛋白质组装。构建体 3 可对 sfGFP 进行设计，该 sfGFP 可由 CFPS 表达，以进行以下蛋白质组装。构建体 2 在体内表达并纯化以与所述两种 sfGFP 构建体连接，形成设计的混合三蛋白复合物（即 sfGFP-mCherry-sfGFP），可固定在大肠杆菌细胞表面。
将第一个构建体转化到大肠杆菌中以表达 LppOmpA-sfGFP-SpyTag 以进行表面展示。此外，研究人员在 LppOmpA 和 sfGFP-SpyTag 之间添加了一个蛋白酶（人鼻病毒 (HRV) 3C）切割位点，允许通过 HRV 3C 蛋白酶消化将 sfGFP-SpyTag 从细胞表面释放。HRV 3C 蛋白酶识别序列 LEVLFQGP 并在残基 Q 和 G 之间进行精确切割。用 L-阿拉伯糖诱导后，将大肠杆菌细胞孵育 10 小时以进行蛋白质表达和表面展示，然后进行收集和表征。
研究数据证实，sfGFP-SpyTag 已通过 LppOmpA 展示系统成功展示在大肠杆菌表面，并可被 HRV 3C 蛋白酶识别。
展示了细胞表面展示系统后，通过体内表达和纯化制备了第二种蛋白质 SpyCatcher-mCherry SnoopCatcher。此外，研究人员评估了第三种蛋白质 SnoopTag-sfGFP 在 CFPS 反应中的表达。数据显示，SnoopTag 融合的 sfGFP 可以很好地表达，产量与对照 sfGFP 相当。然后，将这三种蛋白质部分混合在一起，看看它们是否可以与肽/蛋白质标签组装在一起。
结果显示，SpyCatcher-mCherry-SnoopCatcher 与表面展示的 LppOmpA sfGFP-SpyTag 清晰地组装在一起，产生了一条接近 100 kDa 的较高蛋白质带，接近蛋白质复合物的大小（理论上为 96.9 kDa）。通过添加第三种蛋白质 SnoopTag-sfGFP，观察到 100 至 150 kDa 之间的顶部蛋白质带，这是组装的三蛋白复合物。
总体而言，这些数据证明了使用细胞表面展示、纯化和无细胞表达的蛋白质可以构建蛋白质复合物的概念，这表明构建用于生物催化的混合酶复合物系统是可行的。
接下来，研究人员着手构建包含三种酶 StyA、StyB 和 SpEH 的混合生物催化系统，以从苯乙烯合成 (S)-PED。
为此，SpEH 展示在大肠杆菌表面（LppOmpA-SpEH-SpyTag）；StyA 在体内表达并纯化（SpyCatcher-StyA-SnoopCatcher）；StyB 由于在异源体内表达中不溶解而无细胞表达（SnoopTag-StyB）。这三种酶的表达也得到了验证。
▲图丨组装 StyA、StyB 和 SpEH 进行级联生物转化（来源：ACS Synthetic Biology）
然后，研究人员通过共价组装将三种酶结合在一起，生成用于顺序生物催化的混合酶复合物。值得注意的是，一旦酶组装起来，与未组装的自由浮动酶系统相比，(S)-PED 的最终产物产量增加了 3 倍。
掌握了这种混合生物催化系统后，研究人员接下来寻求进一步优化反应条件以提高级联生产率。
由于StyA 和 SpEH 是级联生物转化中的两种关键酶，研究人员主要关注以及优化它们在反应系统中的用量。
首先，研究人员改变了 SpyCatcher-StyA SnoopCatcher 的浓度，范围从 5 到 20 μM。当使用 20 μM StyA 时，(S)-PED 的最高产量达到 116.8 μM，与使用 5 μM StyA 获得的产量相比提高了 3.5 倍。
然后，研究人员优化了 SpEH 的量。将新鲜制备的细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中，然后以不同的最终细胞密度（1、4 和 5 g cdw/L（cdw，细胞干重））添加到组装反应中。最佳细胞密度为 5 g cdw/L，可产生 229.3 μM 的 (S)-PED。
此外，研究人员研究了底物苯乙烯对 (S)-PED 合成和总转化率的影响。显然，随着底物浓度的增加（0.5-5 mM），(S)-PED 的产量可以从 121.5 逐渐提高到 374.2 μM；然而，底物转化率显著降低，从 24.3％ 降至 7.5％。因此，由于其转化率高，0.5 mM 苯乙烯被用于后续的级联反应。
最后，研究人员使用优化的生物催化系统测试了 (S)-PED 形成的时间过程，总共 24 小时。结果表明，在最初 4 小时内，产品合成相对较慢。随后，产品迅速积累，几乎呈线性增加。最终，在 24 小时时实现了 (S)-PED 的最大产量，为234.6 μM，基于起始底物（0.5 mM 苯乙烯）的总转化率为46.9%。
总体而言，研究人员提出了三种系统的组合，用于构建体外一锅级联反应。通过组装 SpEH（表面展示）、StyA（纯化）和 StyB（无细胞表达）展示了体外高效生物催化系统的构建，用于从苯乙烯合成 (S)-PED。
这一方法有几个关键特点。首先，具有表面展示酶的细胞可以直接作为支架来固定参与级联生物催化的其他酶。其次，CFPS 能够实现 StyB 的可溶性表达，而 StyB 只能在大肠杆菌中表达为不溶性包涵体。通过切换到 CFPS 系统，TxtD 和 BesB 酶都可以以可溶形式表达，并具有催化活性，但它们的可溶性表达无法在大肠杆菌细胞中实现。第三，通过标签/捕手（Tag/Catcher）组装对多种酶进行空间组织，提高了三酶复合物的整体性能，与自由浮动酶系统相比，最终产品产量提高了 3 倍。
原则上，如果可用，可以通过合理设计和选择其他标签对（例如短肽对 RIAD/RIDD）在体外组装更多的酶。
研究人员也指出了该系统存在的局限性。例如，无法确定细胞表面显示的酶（本研究中的 SpEH）的数量。因此，当将这三种组分混合进行酶组装和生物催化时，可能导致三种组分组装不完整，因为在组装反应中添加了额外的酶。
展望未来，研究人员设想，当活细胞、纯化酶和无细胞表达本身仍然困难或不适合时，这种方法将为重建生物合成途径以合成有价值的化学品提供一种新的解决方案。
素材来源官方媒体/网络新闻
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