撰文 | 木兰之枻

CRISPR-Cas9系统是当下基因编辑的主流技术，在基础研究和临床转化领域具有广泛的应用前景。这其中SpCas9核酸酶最早被应用于真核生物的基因编辑研究，也是CRISPR-Cas系统中的“顶流”【1，2】。考虑到SpCas9的PAM序列局限性及在细胞内易聚集且热稳定性差等不足，研究者相继开发出多种不同类型的Cas9如GeoCas9以拓展适用场景【3，4】。与SpCas9相比，GeoCas9热稳定性更高，更适合通过核糖核蛋白 （RNP） 复合物的形式递送至细胞内开展基因编辑研究，这能促进CRISPR-Cas9系统在临床治疗中的应用【5】。不过哺乳动物细胞中GeoCas9的基因编辑效率偏低，不利于其广泛应用。为解决这一难题，研究者借助细菌内的蛋白定向进化系统对GeoCas9进行优化，开发的突变体iGeoCas9具有更高的基因编辑效率且热稳定性不受影响。尽管如此，iGeoCas9编辑效率提升的原因仍不清楚。

2024年5月22日，来自加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna实验室在Cell杂志上发表题为Rapid DNA unwinding accelerates genome editing by engineered CRISPR-Cas9的论文。文章通过单颗粒冷冻电镜结构解析和生化实验指出，iGeoCas9中位于WED功能域的相关点突变能增强其与DNA的结合能力并加速DNA解旋，最终增强iGeoCas9在哺乳动物细胞中的基因编辑效率。文章还证实，对其它不同类型Cas9蛋白的WED结构域进行相似的理性设计同样能增强基因编辑效率，这为基因编辑技术优化提供了新思路。

与野生型GeoCas9相比，蛋白质工程改造的高活性GeoCas9 （iGeoCas9） 携带有多个点突变，分别位于Rec （E149G、T182I、N206D） 、RuvC （P466Q） 、PLL （Q817R） 和WED （E843K、E884G和K908I） 功能域。为探索点突变影响GeoCas9活性的机制，研究者首先通过单颗粒冷冻电镜技术对GeoCas9和iGeoCas9突变体进行结构解析。结果显示，WED功能域的点突变能改变其与双链DNA磷酸骨架的结合能力。其中，E843K突变可与靶向链DNA （TS DNA） 的磷酸骨架形成新的静电互作，K908R突变能增强蛋白与非靶向链DNA （NTS DNA） 的结合。此外E884G也具有增强蛋白-核酸互作的效果。总体而言，WED功能域点突变能促进DNA双链解旋和R-loop形成，这对DNA切割至关重要。

研究还发现，与野生型相比，iGeoCas9拥有更宽松的PAM识别序列：野生型GeoCas9的PAM识别序列为5’-N4CWAA-3’，而iGeoCas9则为5’-N4CNNN-3’。该结果提示我们， 虽然iGeoCas9的PAM结合功能域保持不变，但其DNA解旋和催化能力的提升拓展了PAM识别序列的多样性。后续的生化实验还发现，与野生型相比，iGeoCas9在非传统PAM位点的DNA熔解动力学有明显改善。

野生型GeoCas9在细菌和体外生化实验中的DNA切割能力很强，但在哺乳动物细胞内则明显降低，这或许是因为哺乳动物细胞内的自由镁离子浓度偏低（0.1-1 mM）。生化实验发现，低镁离子浓度条件下，野生型GeoCas9切割DNA的能力降低约17倍，但iGeoCas9的DNA切割能力不变。机制研究指出，镁离子浓度能降低野生型GeoCas9介导R-loop形成过程的中后期速度，但对iGeoCas9并无明显影响。这提示iGeoCas9是通过促进R-loop形成过程中后期的DNA解螺旋速度而增强其在哺乳动物细胞内的基因编辑效率。

最后，研究者发现，WED功能域点突变增强GeoCas9基因编辑效率的机制具有普适性。在Nme2Cas9中引入类似的WED功能域点突变可有效增强其基因编辑效率并拓展PAM识别位点。

总体而言，研究者通过蛋白结构解析和生化实验证实，GeoCas9的WED功能域改造能促进R-loop形成和DNA解螺旋，最终拓展其PAM识别位点并增强基因编辑效率。研究还发现，WED功能域改造增强CRISPR系统基因编辑效率的机制具有普适性，可用于多种不同类型CRISPR-Cas9的改造优化，这为CRISPR相关基因编辑技术的升级提供了新思路。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.031

参考文献

1. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science339, 823–826 (2013).

2. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science339, 819–823 (2013).

3. Harrington, L.B., et al. (2017). A thermostable Cas9 with increased lifetime in human plasma.Nat. Commun.8, 1424.

4. Mougiakos, I., et al. (2017). Characterizing a thermostable Cas9 for bacterial genome editing and silencing.Nat. Commun. 8, 1647.

5. Chen, K., et al. (2023). Lung and liver editing by lipid nanoparticle delivery of a stable CRISPR-Cas9 RNP. Preprint atbioRxiv.https://doi.org/10.1101/2023.11.15.566339.