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基因编辑发展应用进入新的十年，对于CRISPR系统的认识和挖掘已经较十年前有质的飞跃。这个过程中V型效应子Cas12家族蛋白凭借其万花筒般的基础功能吸引着大批量的研究人员参与表征与应用研究。

近日，华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、岭南现代农业科学与技术广东省实验室、农学院和生命科学学院刘耀光院士/祝钦泷研究员团队在生物工程领域国际著名期刊Biotechnology Advances在线发表了题为The type V effectors for CRISPR/Cas-mediated genome engineering in plants的研究综述，系统总结了V型效应蛋白CRISPR/Cas12的结构特点、新效应蛋白的挖掘方法、效应器蛋白的工程化改进，及其在碱基编辑器、基因表达调节工具、基因敲入和生物传感器中的最新应用进展，为V型CRISPR/Cas12效应蛋白在作物遗传改良和提高农业生产等方面的应用，提供了研究思路与有益的参考。

在众多CRISPR系统中，用于识别CRISPR的典型的基因为cas1、cas2、cas4等，这些基因编码的效应蛋白以不同的形式组合，最终使得CRISPR系统中Cas蛋白呈现不同的功能。根据Cas效应蛋白组成，CRISPR/Cas系统分为Class Ⅰ和Class Ⅱ两类，根据其作用方式进一步划分了六种类型 (Type Ⅰ~ Ⅵ)。其中Class Ⅰ (Type Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ)需要多个蛋白亚基组成复合体共同作用才能够发挥功能，而Class Ⅱ (Type Ⅱ, Ⅴ, Ⅵ) 则只需在单一Cas蛋白与相应向导RNA (guide RNA)介导下发挥针对核酸链的干扰功能（图1）。尽管目前已经挖掘并检测到多个CRISPR Cas系统能够在体外发挥DNA切割和操纵的能力，但是目前在真核细胞中能够高效作用系统仍旧只有SpCas9（Class Ⅱ -Type Ⅱ）和AsCas12a（Class Ⅱ-Type Ⅴ）。

图1. 各类CRISPR系统的特点及Type V CRISPR系统的系统发育树。

对比Cas9，Cas12拥有多个不同的特征，总结如下：1) 单个RuvC核酸酶结构域切割产生粘端DNA双链断裂，特别有利于产生基于HDR的修复，从而提高植物中的精准基因编辑效率；2) 这些蛋白质的结构更紧凑，导致其尺寸更小。 Cas12f 等较小的蛋白质有利于基于病毒的转化，因为它们更易于使用；3) Cas12效应子的顺式和反式切割能力使其可用于开发更方便的生物传感器；4)部分V型效应子（如Cas12a、i、j、m）不需要tracrRNA，有利于crRNA的组装实现植物中的多基因编辑。

该综述详细介绍了目前Class II CRISPR基因编辑系统的效应蛋白和crRNA确定的方法，为新进入该领域的研究工作者提供参考（图2）。

图2. Class II CRISPR系统的发现流程图。

Type V效应器的挖掘和开发已取得许多进展，但它们在植物中的应用仍然有限。加速这些工程化的效应器在植物系统中应用用对于拓宽植物基因编辑工具包至关重要。通过对多个氨基酸突变产生的成功案例的分析，以及蛋白3D结构和一级结构中进行关键氨基酸的映射标注，发现Type V效应子的修饰主要集中在DNA/RNA结合域，这些氨基酸通常位于DNA/RNA分子的几个Å（ångströms）内（图3）。这为未来效应器工程和核酸酶定向进化提供了宝贵的见解。

图3. V型效应器工程改造的现状。A. AsCas12a 的工程化改造 B. LbCas12 的工程化改造。C. Cas12c 的工程化改造。D. Cas12f 的工程化改造。E. Cas12i 的工程化改造。某些氨基酸无法在 PDB 数据库的蛋白质模型中显示。

除了结构和分类上详细的总结，该文还侧重于归纳Type V效应器在植物和动物中的多种应用的现状，包括它们作为碱基编辑器（BE）、调节基因表达的工具、基因打靶（GT）和生物传感器（图4）。

图 4. V 型效应器的生物学应用。A. Type V效应子（Cas12蛋白）和Cas9蛋白之间的差异。B. 基于Cas12的碱基编辑工具原理。C.基于Cas12的基因表达调控原理。D. CRISPR 相关转座酶 (CAST) 的原理。E. 基于 Cas12 的植物生物传感器。

综上，深度学习和从头蛋白质设计的整合在加速 Cas 效应系统的开发方面具有巨大的前景，并有助于创建具有增强功能的基因操作工具。与针对几个关键氨基酸突变相比，对Cas12的关键肽段或三维结构进行更精细的优化或重新设计可以实现更大、更精确的调整。这种方法通常需要更强大的预测和计算能力。利用人工智能辅助设计代表了一个非常有前途方向。此外，Cas12家族成员相对保守但功能多样且结构紧凑，有利于目标蛋白的从头设计。鉴于基因编辑在修改遗传信息方面的重要意义，Cas12 具有成为未来蛋白质设计和工程化改造与应用平台的巨大潜力（图5）。

图5. 基于Cas9和Cas12系统的基因编辑工具包为生物传感器、表观遗传编辑器、基因打靶、基因敲除、碱基编辑器甚至植物组织特异性基因编辑提供了全面的解决方案。

博士生张瑞祥，博士后柴楠为该论文的共同第一作者，祝钦泷研究员与刘耀光院士为论文的共同通讯作者。林秋鹏教授和谢先荣副研究员参与了论文的讨论。该研究得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、广东省基础与应用基础研究重大项目和广东省“十四五”农业科技创新十大重点项目的资助。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0734975024000764