导读

6-姜辣素（6-G）是生姜的一种有效成分，具有抗炎和抗氧化作用，可治疗溃疡性结肠炎，然而，其根本机制仍不清楚。本研究对6-G改善UC进行了药效学评价，并通过血浆代谢组学和网络药理学分析挖掘了6-G改善UC的机制，通过实验和分子对接进一步验证了6-G的作用机制。结果表明，6-G能显著减轻UC小鼠的腹泻、体重减轻、结肠病理损伤和炎症。血浆代谢组学结果表明，6-G可调节19种差异代谢产物，其代谢途径主要涉及亚油酸代谢和花生四烯酸代谢，与铁死亡密切相关。此外，本研究通过网络药理学确定了6-G干预UC铁死亡的60个潜在靶点，富集分析表明6-G通过调节脂质过氧化来抑制铁死亡。此外，代谢组学和网络药理学的整合表明，6-G对铁死亡的调节集中在3个关键靶点，包括ALOX5、ALOX15和PTGS2。进一步的研究表明，6-G通过降低UC小鼠和RSL3诱导的Caco-2细胞的铁负荷和丙二醛（MDA）来显著抑制铁死亡，并通过降低谷胱甘肽二硫化物（GSSG）含量和提高超氧化物歧化酶（SOD）以及谷胱甘肽（GSH）水平来增强抗氧化能力。此外，分子对接显示6-G与已鉴定的3个关键靶点具有高亲和力。总之，本研究阐明了6-G通过抑制铁死亡改善UC的潜力，该综合策略也为6-G改善UC提供了理论依据。

论文ID

原名：6-Gingerol ameliorates ulcerative colitis by inhibiting ferroptosis based on the integrative analysis of plasma metabolomics and network pharmacology

译名：基于血浆代谢组学和网络药理学的综合分析，6-姜辣素通过抑制铁死亡改善溃疡性结肠炎

期刊：Food & Function

IF：6.1

发表时间：2024.05

通讯作者：段金廒，江曙

通讯作者单位：南京中医药大学

实验设计

实验结果

1.6-G对DSS诱导的结肠炎的改善作用

在本实验中，对照小鼠的机体体征良好，而UC小鼠的精神状态较差，皮毛无光泽，行动缓慢，食物摄入减少，粪便潜血。此外，与对照小鼠相比，UC小鼠体重减轻，DAI评分增加，结肠长度缩短，表明UC小鼠模型成功建立。然而，6-G显著逆转了这些异常变化（图1A–D）。

通常，对结肠组织的严重损伤是UC的特征。我们对结肠组织进行H&E染色以观察病理变化。结果显示，UC小鼠结肠组织表现出黏膜上皮严重破坏、杯状细胞减少和炎症细胞浸润，而6-G显著逆转了这些病理症状（图1E和F）。此外，结肠组织中炎性细胞因子含量的变化被用来阐明6-G对UC小鼠炎症的影响。如图1G–I所示，UC小鼠的IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著高于对照小鼠。相反，与UC小鼠相比，6-G显著降低了这些炎症细胞因子。这些结果表明6-G可以减轻小鼠UC。

图1 6-G对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的影响。（A）体重；（B）疾病活动指数；（C）结肠组织的代表性图片；（D）结肠长度；（E）结肠组织学评分；（F）结肠组织的代表性H&E染色（放大倍数，100×；比例尺，100μm）；（G–I）IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。数据以平均值±SEM表示。与对照组比较##P＜0.01；与DSS组相比，*P<0.05和**P<0.01。

2. 6-G对UC小鼠血浆代谢组学的调控

为了探讨6-G改善UC的潜在机制，我们通过UPLC-Q-TOF/MS分析各组小鼠血浆中的代谢谱。我们进行PLS-DA以观察各组的总体代谢产物差异和组内变化的幅度。结果显示，来自对照组和UC组小鼠的血浆样本聚集在组内，并在组间分离，这表明UC小鼠的血浆代谢产物受到干扰。然后，我们进一步分析6-G给药后各组血浆代谢产物的差异。结果显示，与UC小鼠相比，6-GL（低剂量）和6-GH（高剂量）处理的小鼠的血浆代谢谱接近对照小鼠的血浆代谢谱（图2A和B），提示6-G可调节UC小鼠血浆中的异常代谢产物。

我们通过OPLS-DA模型分析了6-G改善UC的潜在血浆代谢产物，该模型通过置换检验显示出良好的拟合性，表明所建立的模型是合理和可靠的（图2C–F和图S1，S2†）。最终，我们鉴定出19种显著的差异代谢物（表1）。与对照小鼠相比，UC小鼠血浆中的花生四烯酸（AA）、亚油酸（LA）、12-Oxo-20-三羟基-白细胞三烯B4（DOxLTB4）、前列腺素G22-甘油酯（PGG22-甘油酯）、9,10-环氧十八烯酸（9,10-EOA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）和胆酸显著增加，而8，9-环氧二十碳三烯酸（8，9-EET）、glycerophospho-N-arachidonoyl ethanolamine（GpAEA）、磷脂酰胆碱（PC）、溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺显著降低。在6-G干预后，所有这些代谢产物都被逆转了。为了探索6-G调控的潜在代谢途径，我们将19种已鉴定的血浆代谢物输入Metaboanalyst进行代谢途径分析。如图2G所示，这些代谢途径包括LA代谢、AA代谢、甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成、α-亚麻酸（ALA）代谢和初级胆汁酸生物合成。其中，根据代谢途径影响值>0.1和−log10（p）>2，LA代谢和AA代谢被认为是最具影响力的途径（表S3†）。此外，我们根据KEGG数据库构建了代谢途径网络（图2H），发现LA代谢和AA代谢与可能参与铁死亡的脂质过氧化密切相关。

图2 小鼠血浆样品的代谢组学分析。（A和B）PLS-DA在正离子模式和负离子模式下的得分图；（C和D）正离子模和负离子模下OPLS-DA模型的S图；（E和F）从正离子模式和负离子模式下的200个置换检验中获得的OPLS-DA模型的验证图；（G）潜在代谢产物的代谢途径；（H）代谢产物网络，红色和蓝色的代谢产物代表的水平分别受到6-G的影响而增加和减少。（DOxLTB4:12-oxo-20-三羟基-白三烯B4；LTB4:白三烯B4；8,9-EET:8,9-环氧二十碳三烯酸；PGG2:前列腺素G2；AA:花生四烯酸；PE-AA:花生四烯酸-磷脂酰乙醇胺；LA:亚油酸；9,10-EOA:9,10-环氧十八碳烯酸；ALA:α-亚麻酸；EPA:二十碳五烯酸；DHA:二十二碳六烯酸；PC:磷脂酰胆碱；LysoPC：溶血磷脂酰胆碱；PE：磷脂酰乙醇胺；LysoPE：溶血磷脂酰乙醇胺；AEA:N-丙烯酰胺；GpAEA：glycerophospho-N-arachidonoyl ethanolamine）。

3. 6-G对UC铁死亡作用的网络药理学分析

网络药理学分析可以阐明药物的潜在靶点和途径。因此，它被用于探索6-G是否可以调节UC的铁死亡。如图3A所示，通过匹配6-G、UC和铁死亡的靶点，我们获得了60个6-G干预UC铁死亡的靶点。然后，我们应用Cytoscape构建PPI网络，并鉴定出具有高degree值的前10个靶点（MAPK3、PTGS2、EGFR1、JUN、PPARG、ALB、NFKB1、TP53和STAT3）（图3B）。这些结果表明6-G可以调节UC中铁死亡相关基因的表达。

表1 6-G干预UC小鼠血浆潜在生物标志物的详细信息

潜在生物标志物的水平被标记为上调(↑) 和下调(↓)。与对照组比较，#P<0.05和##P<0.01；与DSS组比较，*P<0.05和**P<0.01。


随后，我们对获得的潜在靶点进行GO和KEGG途径富集分析。GO分析显示，这些潜在靶点主要位于囊泡腔、分泌颗粒腔和细胞质囊泡腔，调节MF如DNA结合转录因子结合、RNA特异性聚合酶II-DNA结合转录因子结合和磷酸酶结合，并参与BP如对营养水平、化学应激和氧化应激（OS）的反应（图3C）。此外，KEGG分析的结果表明，受影响最显著的途径是脂质和ROS（图3D）。重要的是，ROS的积累可能引发脂质过氧化，最终导致铁死亡。这些发现与血浆代谢组学分析结果一致，并证明6-G可能通过调节OS来抑制UC的铁死亡。

图3 6-G改善UC的靶点及网络分析。（A）6-G、UC和铁死亡交叉靶点的Venn图；（B）PPI网络中的潜在靶点，圆圈较大、颜色较深的节点表示更重要的靶点；（C）GO富集分析直方图，涉及生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MFs）；（D）KEGG途径的气泡图。

4. 血浆代谢组学与网络药理学的综合分析

为了评估通过网络药理学分析的UC中6-G调节的铁死亡靶点与鉴定的代谢物之间的相关性，我们进一步分析了代谢产物的相关靶点，通过将已鉴定的差异代谢产物导入Cytoscape以构建代谢产物-反应-酶-基因网络，共获得88个代谢产物靶点（图S3†）。随后，我们将这些代谢产物靶点与网络药理学分析确定的60个靶点进行匹配，得到3个关键靶点：ALOX5、ALOX15和PTGS2。特别是6-G对PTGS2的影响最大（图4A）。进一步分析显示，这些靶点与3种代谢产物有关，包括AA、PGG2 2-甘油酯和LA，涉及LA代谢和AA代谢（图4B）。

图4 代谢组学分析和网络药理学预测的合并网络。（A）UC中代谢产物与6-G调节的铁死亡交叉靶点的维恩图；（B）6-G靶点-代谢途径-代谢产物的相互作用网络。

6. 6-G对减轻UC的铁死亡作用的验证

铁死亡最明显的特征是铁和脂质过氧化物的积累。MDA是脂质过氧化物最丰富的最终产物。如图5A和B所示，与对照小鼠相比，UC小鼠结肠中的铁和MDA水平显著增加，这表明UC中存在铁死亡。6-G能显著降低血清铁和MDA含量，表明6-G抑制UC的铁死亡。然后，我们在体外验证了6-G对铁死亡的作用。如图5C所示，浓度低于100μM的6-G对Caco-2细胞没有显著的抑制作用。此外，用RSL3（铁死亡诱导剂）处理Caco-2细胞以建立铁死亡模型，用于探索6-G对铁死亡的影响。结果表明，6-G的浓度增加后，RSL3抑制的细胞活性被显著逆转（图5D）。此外，RSL3诱导的Caco-2细胞中的铁和MDA水平显著高于对照细胞，6-G处理显著抑制了这些水平（图5E和F）。这些结果阐明6-G可以减轻RSL3诱导的Caco-2细胞的铁死亡。

图5 6-G对UC小鼠和RSL3诱导的Caco-2细胞铁死亡作用的影响。（A）结肠组织中的铁含量；（B）结肠组织MDA含量；（C）用6-G处理的Caco-2细胞的活力；（D）100 μM RSL3和不同浓度的6-G共同处理的Caco-2细胞的活力；（E）Caco-2细胞中的铁水平；（F）Caco-2细胞中MDA的水平。（G–I）结肠组织中GSH、GSSG和SOD的水平；（J–L）Caco-2细胞中GSH、GSSG和SOD的水平；（M）UC患者和健康人结肠组织中ALOX5、ALOX15和PTGS2的表达水平；（N）6-G与ALOX5、ALOX15和PTGS2的分子对接。数据以平均值±SEM表示。与对照组或正常组比较，#P＜0.05和##P＜0.01；与DSS组或RSL3组相比，*P<0.05和**P<0.01。


已证实6-G对UC铁死亡的调节与OS密切相关（图3）。因此，我们对OS相关指标的变化进行了评估。结果表明，GSH和SOD水平显著降低，在UC小鼠结肠和RSL3诱导的Caco-2细胞中，GSSG的含量显著增加。然而，6-G可以显著逆转上述参数的变化（图5G–L）。此外，基于综合代谢组学和网络药理学的结果（图4），我们进一步分析了靶点如ALOX5、ALOX15和PTGS2在UC数据集GSE87466中的表达。结果显示，这些靶点在UC患者中的表达明显高于健康人（图5M）。据报道ALOX5、ALOX15和PTGS2的过表达可能导致铁死亡。此外，我们应用分子对接来分析6-G与这些靶点之间的结合能力。如图5N所示，6-G与所有这些靶点的结合能均小于−5 kcal mol−1，表明6-G与ALOX5、ALOX15和PTGS2具有强大的结合活性。这些发现进一步证明，6-G可以通过抑制铁死亡来减轻UC。

图6 6-G对抗UC铁死亡的机制图

UC已成为一种常见的消化系统疾病，其反复发作被认为会增加患癌症的风险。然而，目前UC的治疗药物由于其毒性和副作用而限制了其应用。因此，膳食化合物因其在治疗副作用较少的疾病方面的优势而越来越受到关注。本研究结合血浆代谢组学和网络药理学，全面探讨了6-G对UC的改善作用及其潜在机制，并通过分子对接和实验进行了进一步验证。结果表明，6-G可通过逆转紊乱的血浆代谢产物和抑制铁死亡来减轻UC。

6-G是生姜中最具生物活性的酚类成分，具有成本低、安全、易得等优点，满足了人们对天然药物日益增长的需求。此外，6-G可以通过体循环分布在肠道中，因此在治疗肠道疾病方面具有突出的疗效。近年来，DSS诱导的UC小鼠模型因其临床症状相似、成功率高、可重复性强而成为应用最广泛的UC动物模型。本研究成功建立了DSS诱导的UC小鼠模型，主要表现为体重减轻、便血、严重结肠损伤和炎症侵袭，6-G可显著逆转这些症状。

先前的研究表明，UC的发展过程中存在血浆代谢紊乱。因此，血浆代谢谱的变化可能揭示6-G改善UC的潜在机制。本研究鉴定了19种6-G可显著调节的代谢产物，主要涉及LA代谢、AA代谢、甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成、ALA代谢和初级胆汁酸生物合成。总之，这些途径参与了脂质代谢。据报道，UC患者患有胆汁酸吸收不良和肝胆功能异常，这可能导致血浆胆汁酸水平升高。此外，过量的胆汁酸会破坏黏膜屏障，诱导异常免疫反应并引发肠道炎症。本研究表明，UC小鼠血浆中的胆酸（一种常见的胆汁酸）增加，而6-G干预后其水平显著降低。PC和磷脂酰乙醇胺（PE）是胃肠道中的主要磷脂，可以保护肠细胞免受损伤。然而，它们可以被磷脂酶A2（PLA2）水解为LysoPC和LysoPE。LysoPC可以通过诱导自然杀伤细胞和T淋巴细胞的活化来预防感染。LysoPE被证明可以减少UC小鼠的炎症、黏膜损伤和肠道通透性。特别是，据报道，UC患者的PC水平降低，因为PC可以被分泌型PLA2切割为炎症性AA。此外，PE也是生成GpAEA的前体，可以水解成AA。该研究表明，在UC小鼠中，甘油磷脂代谢途径中的这些代谢产物（PC、LysoPC、LysofPE和GpAEA）显著减少，这表明PC可能代谢为AA、LA和ALA（图2H）。生理上，ALA可以级联代谢为EPA和DHA。先前的一项研究发现，IL-10敲除UC小鼠血浆中的DHA水平升高，这与DHA的可用性降低有关。这项研究的结果也与此一致：UC小鼠血浆中的EPA和DHA显著升高，而UC小鼠的上述紊乱代谢产物在6-G处理后趋于正常。

特别是6-G对LA和AA代谢有更大的影响，这两种代谢都属于多不饱和脂肪酸（PUFA）代谢。PUFA是细胞膜的组成部分，具有多种生物学功能，包括调节炎症、能量供应和细胞生长。具体而言，在LA代谢中，据报道，适量的LA对炎症具有抑制作用，并促进脂质代谢。然而，过量摄入LA增加了UC的发生率，这可能与LA中不饱和双键对氧化的易感性有关。9,10-EOA是LA的过氧化产物，已被证实具有细胞毒性和促炎作用。这项研究证实，UC小鼠血浆中的LA和9,10-EOA显著升高，而6-G可以减少这些代谢产物。此外，LA可以代谢为AA，AA通过环氧合酶（COX）、脂氧合酶（LOX）和细胞色素P450环氧合酶途径代谢，产生不同的生物活性介质，包括前列腺素、白三烯和花生四烯酸，这些介质与炎症相关的各种疾病过程有关。AA的代谢产物会刺激肠腔并促进肠道炎症，从而加剧UC。AA可以通过COX转化为PGG2，PGG2的羧基可以与甘油缩合形成PGG2 2-甘油酯。结果表明，PGG2 2-甘油酯的功能与PGG2有关，其水平与炎症和OS环境呈正相关。此外，AA可以被ALOX5代谢为LTB4，然后进行ω-高氧化以产生DOxLTB4，从而促进炎性细胞因子的产生。此外，AA可被CYP450代谢为8,9-EET，被认为具有血管舒张和抗炎特性。然而，8,9-EET可以降解为具有促炎作用的脂肪酸二醇。因此，8，9-EET的适当升高可能会缓解UC。在本研究中，UC小鼠的AA、DOxLTB4和PGG2 2-甘油酯水平显著升高，而8,9-EET水平显著降低。然而，在6-G给药后，这些改变显著逆转。提示6-G可降低促炎脂质的代谢，有利于抑制肠道炎症和细胞损伤。早期的研究表明，LA和AA可以显著增加GPX4（一种抑制铁死亡蛋白）缺陷细胞的死亡。PUFA被强烈证明与铁死亡有关。最近的一项研究进一步证明，ALOX15从AA衍生的代谢产物15-羟基二十碳四烯酸可以促进细胞铁死亡。因此，6-G对PUFA相关代谢的调节可能涉及铁死亡。

如上所述，代谢组学分析可以揭示6-G改善UC的代谢特征，但不能完全揭示其调节机制，而网络药理学可以弥补其不足。因此，应用代谢组学和网络药理学相结合的分析方法，我们鉴定了60个与6-G调节的铁死亡相关的UC靶点，验证了6-G可以通过影响铁死亡来改善UC的假设。多项研究证实，肠细胞铁死亡与UC的病理有关，抑制铁死亡性腹泻有利于缓解UC。铁死亡的经典过程是，过量的细胞内铁通过Fenton反应产生大量ROS，诱导脂质过氧化的终产物，如MDA的产生，从而导致细胞死亡。该研究表明，6-G显著降低了UC小鼠和RSL3诱导的Caco-2细胞中过量铁和MDA的水平，进一步证实了6-G通过抑制铁死亡改善UC。

减少脂质过氧化物的积累对于通过两种主要方式减轻铁死亡至关重要：促进脂质过氧化物的减少和抑制脂质过氧化物的形成过程。越来越多的证据表明铁死亡与高OS环境密切相关。不仅如此，OS还被认为是UC的一个重要致病因素。在生理条件下，肠细胞可以通过各种抗氧化分子来对抗OS。GSH和SOD是丰富的细胞内抗氧化剂，可以通过减少过氧化物来减轻细胞氧化损伤。据报道，GSH含量和SOD活性的降低可能导致OS，OS易引起PUFA的过氧化，尤其是含AA的PE。因此，6-G对铁死亡的抑制可能与肠细胞的抗氧化能力有关，本研究中的GO和KEGG分析证实了这一点。此外，进一步的结果表明，6-G在体外和体内显著逆转了SOD活性和GSH含量的降低以及GSSG含量的升高。这些数据进一步支持6-G可以通过增强肠细胞减少脂质过氧化物的抗氧化能力来抑制铁死亡。

此外，综合分析表明，6-G可以通过调节ALOX5、ALOX15和PTGS2来影响LA和AA的代谢。据报道，来自细胞膜的AA可以酯化为PE-AA，然后由LOX催化为脂质过氧化物。显然，产生的脂质过氧化物越多，膜孔越容易形成，这可能会影响细胞的存活。LOX表现出催化不同脂质化合物的多种异构体（ALOX5、ALOX15和ALOX12），是铁死亡的关键触发因素。几项研究表明，抑制或敲低ALOX5可减少细胞铁死亡。此外，ALOX15的特异性抑制可以减少AA衍生的代谢产物，从而抑制脂质过氧化，防止铁死亡。此外，ALOX15的表达被证明受PTGS2的调节，这也被认为是铁死亡的重要标志。此外，6-G可以抑制在UC小鼠中高表达的PTGS2。这项研究的结果表明，ALOX5、ALOX15和PTGS2的表达水平在UC患者中显著增加，并且6-G对这些靶点具有良好的结合活性。所有这些结果进一步证实了6-G可以通过减少脂质过氧化物的产生来抑制UC的铁死亡。然而，还需要进一步深入的研究来阐明6-G是否通过抑制这3个关键靶点来减轻UC的铁死亡。

结论

在这项研究中，我们发现6-G能显著减轻小鼠的UC。在此基础上，血浆代谢组学分析显示，6-G可以调节UC小鼠血浆中的19种差异代谢产物，主要涉及LA和AA代谢，这些代谢产物与铁死亡有关。此外，血浆代谢组学和网络药理学的综合分析表明，6-G专注于3个关键靶点（ALOX5、ALOX15和PTGS2），以调节UC中的铁死亡，与脂质过氧化相关。体外和体内实验以及分子对接支持6-G可以减少脂质过氧化物的积累，以抑制与3个关键靶点的调节相关的铁死亡（图6）。总之，这些发现为6-G治疗UC提供了初步的科学依据，也说明了综合研究策略在阐明该药物治疗机制方面的潜力。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38753306/

中药成分鉴定及入血分析：

多组学测序服务：

1.代谢组学(非靶/靶向)：300起

2.转录组测序：480起

3.蛋白质组学：1500元起

相关咨询，加微信：1278317307。

【福利时刻】科研服务（点击查看）：、、、、、。咨询加微信：1278317307。