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Olympus倒置双光子显微镜组成和技术参数：

倒置双光子激光扫描显微镜，MaiTai飞秒激光器(波长690～1040nm波段连续可调)，水镜，共聚焦小皿，无创血压测量仪。双光子专用物镜双光子专用物镜，25X水浸物镜，数值孔径为1.05，工作距离为2mm，荧光视场数27.5，配有成像深度校正环(可校正0-0.23mm)，适用于小鼠、果蝇、斑马鱼等活体动物的荧光观察。细胞中存在很多囊泡、脂质体等等折射率不同的亚细胞结构，这些结构在显微成像中充当一个个特殊透镜，IR激光经过这些透镜之后会发生很大的球差，IR激光不能够完美汇聚到焦点，激发效率自然下降。而这个专用镜头通过校正环矫正不同深度球差，IR激光能量更集中，更多荧光素被激发!

物镜清洁：

若使用油镜，需用擦镜纸蘸取无水酒精进行擦拭，无水酒精可以盛放在能按压的玻璃瓶中，使用时轻轻一按，就可按压出来酒精;若使用双光子专用25倍水镜或其它水镜，需要将水镜浸泡在双蒸水中2h以上，然后用擦镜纸擦拭，直至物镜干净。

动物准备：

1%戊巴比妥钠以50mg/kg的剂量腹腔注射麻醉小鼠。鼠尾静脉以1.5g/kg的剂量注射异硫氰酸荧光素。根据不同组织器官可以选择不同分子量的葡聚糖异硫氰酸荧光素染料，如要观察后肢血管可以选择40kD分子量，观察肝脏等通透性较强的组织可以选择70kD以上的分子量。染料注射后静置10min，测量麻醉状态下的孕鼠与正常雌鼠的呼吸、血压、心率。用剃须刀剃去相应组织器官的局部表面的毛发，剪皮除筋膜，暴露组织，将小鼠放置于倒置双光子激光扫描显微镜的37℃恒温载物台上，将组织浸泡在共聚焦小皿内的生理盐水中保持湿润，用合适重量和形状的金属垫片按压，保持组织与皿底贴合。必要时可以使用医用胶带辅助固定小鼠，观察并测量对应组织器官血流速度。

Fig1 倒置双光子活体成像体系的承载及固定

A．打磨自制底边缘共聚焦小皿;B．小鼠肝脏成像时的金属垫片按压固定;C．小鼠后肢成像时的医用胶带及金属片固定图2XYZ三维成像标尺示100μm

A．胚胎胎盘微血管;B．肝脏血窦;C．后肢的微血管三维成像;颜色变化代表深度变化。图3微血管A．XYT三维扫描结果和B．XT一维扫描结果图像计算血流说明示意图

利用倒置双光子激光扫描显微镜进行成像，激发光波长选取750nm，发射荧光接收范围为500～550nm。选取血流和结构清晰的微血管，利用XYZ三维序列扫描可以观察微血管三维立体结构分布，z轴层切扫描步距为1μm，分辨率为512×512像素;利用XYT时间序列扫描观察血流情况，若流速很快，可以将分辨率设置为512×64像素，收窄扫描范围以增加扫描速度。但对于流速较快的小血管，目前普通的点扫描双光子激光扫描显微镜，即使减小分辨率或收窄扫描范围，也无法真正追踪到单个血细胞的血流速度，因此，要想准确的测量微血管的血流速度，需要采用一维时间序列扫描，即XT线扫描监测位移-时间变化，并通过横坐标(x)距离和纵坐标(y)时间计算血细胞的运动速度。

建立倒置双光子激光扫描显微镜活体成像体系的承载及固定装置：

用砂纸打磨商品化的共聚焦小皿，自制出低边缘的共聚焦小皿，既能内盛生理盐水，边缘又不至于太高而阻碍实验动物的平卧。皿底玻璃片下方，水镜无需直接接触组织器官，锁水容易，顺利避开了正置双光子成像时组织锁水困难，观察体位不佳的限制。建立了可以系统、稳定地进行多器官活体微血管三维立体成像和血流流速检测的方法。自制不同重量和大小的金属垫片作为按压的固定装置，使其既能按压实验动物不同形状和大小的器官组织与共聚焦皿底玻璃片贴合，同时又能保证组织血流顺畅通过，达到不受实验动物呼吸、心跳影响的最佳成像效果。如果实验动物俯卧不稳定或组织与皿底贴合不紧密时，可以用医用胶带粘贴稍加固定。如此多个条件实现了双光子活体微血管成像，反映出时间、空间的变化，更加容易获得稳定、可靠、直观的数据，方法简单易行，易于推广。

Fig2 正常雌鼠与孕鼠微血管血流速度比较

A．肝脏;B．后肢

倒置双光子显微镜微血管检测方法可以顺利观察到孕鼠单个胚胎的胎盘微血管、肝脏血窦微血管和后肢微血管。XYZ三维成像可以观察到血管清晰的形态结构，XYT时间序列扫描可以实时监测血管内血流情况。

可以根据微血管XYT序列扫描的成像结果中某一血细胞在前后两张图的位置移动和这两张图扫描时间的间隔计算血流速度。若血流速度很快，XYT扫描不足以捕捉实际流速，可以使用XT一维线扫描成像结果计算。微血管XT一维扫描图像中绿色荧光背景里的黑色线条代表单个血细胞的流动轨迹，每条线条的横坐标代表血细胞移动的位移/微米(distance/μm)，纵坐标代表此段时间/毫秒(time/ms)，根据这两个数据可以计算出单位时间内血细胞的流动速度/(微米·毫秒)［flowspeed/(μm·ms)］。通过对孕鼠和正常雌鼠的肝脏和后肢的微血管进行血流成像并计算发现孕鼠血流更快。

应用场景：

此技术可以检测各组织器官的微循环血管系统三维立体形态学改变，如测量血管内径或复杂程度、迂回度等;可以计算微血管血流速度;还可以反应血管内皮细胞或分泌腺腺泡细胞的通透性等。能广泛适用于活体动物观察荧光示踪分子的流动性、迁移、转位变化、凋亡等实验，除此之外，利用此方法还可以活体观察小鼠皮下接种的肿瘤微血管，研究纳米给药、药物释放等，对治疗肿瘤和抑制肿瘤生长的研究同样可以提供技术支持。

注意事项：

为了获得高分辨率的图像，需要注意以下几点：1.手术过程中，实验人员的动作要细致，时刻关注出血情况，避免污染观察窗口；2.透明化效果决定成像深度和图像信噪比。因此，在透明化试剂配制过程中，实验人员要确保澄清透明无沉淀，且应现配现用，透明时间需要充足，上机前要防止窗口产生气泡干扰。

文献引用：

1.冯婉倩.双光子显微成像系统的应用及开放管理模式探索[J].科学咨询(科技·管理),2024,(02):37-40.

2.李娟,张岚岚,吴珏珩.双光子显微镜的应用优势与维护要素[J].中国医学装备,2021,18(12):158-163.

3.What lava lamps and vinaigrette can teach us about cell biology.[J]. Dolgin Elie.Nature,2018

4.In vivo multiphoton tomography and fluorescence lifetime imaging of human brain tumor tissue.[J]. Kantelhardt Sven R;;Kalasauskas Darius;;König Karsten;;Kim Ella;;Weinigel Martin;;Uchugonova Aisada;;Giese Alf.Journal of neuro-oncology,2016

5.A large, switchable optical clearing skull window for cerebrovascular imaging.[J]. Zhang Chao;;Feng Wei;;Zhao Yanjie;;Yu Tingting;;Li Pengcheng;;Xu Tonghui;;Luo Qingming;;Zhu Dan.Theranostics,2018

6.刘皎,丛馨,何其华.活体小鼠微血管血流倒置双光子激光扫描显微镜检测方法的建立[J].解剖学报,2022,53(02):261-265.

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