近日，美国 Broad 研究所王潇团队在 Nature Biotechnology（IF = 46.9）上发表文章[1]，通过合成多个 polyA 尾部的 mRNA，使其表达时间更长、表达量更高。而多尾 mRNA 有望改善基于 mRNA 的治疗平台，如蛋白替代疗法、干细胞重编程、基因编辑等，具有广泛的临床应用前景。去年哈佛医学院在 Nature Reviews Cancer 发表一篇综述[2]将体外转录 mRNA 应用于癌症治疗，并展望了这一领域的发展趋势。
在实操过程中，mRNA 的制备首先要制备含靶基因的质粒，再用 IVT（In Vitro Transcription）技术在体外进行转录，合成具有治疗属性的 mRNAs。因此，如何高效实现体外转录 mRNA？或许要在纯化质粒上多费心思了。
以下高通量纯化实验的步骤和技巧或许可以给你提供帮助：
1. 细菌培养：
将细菌接种后在 37℃ 培养箱中培养 24 小时，挑取单克隆菌落，在摇床（Innova® S44i 摇床）中扩增并甘油冻存。在 250 mL 培养瓶中预培养，之后再扩增到 2.5 L 培养瓶中培养,并对细菌进行沉淀离心（CR22N 高速落地离心机和R9A2 转子4℃，3,340 xg 离心 30 分钟），将细菌沉淀物重悬用于 DNA 纯化。
2. 质粒纯化：
用 25 mL 缓冲液 P1 重悬沉淀物，并将其分配到 5 x 50 TC 离心管中。加入缓冲液 P2（5 ml）孵育3分钟，然后加入缓冲液 P3（5 ml）。使用R15A 转子，4°C，20,000 xg 离心 30 分钟。
将缓冲液 PE（700 uL）加入柱膜中进行洗涤,并使用R22A4 转子在 4℃，20,000 xg 下将离心柱离心两次,每次 1 分钟。之后在 4℃，20,000 xg 下将离心柱离心两次（1 min），并用 200 μL 水洗脱 DNA。
3. 质粒线性化和纯化：
将含有质粒（500 ng/uL）、5 uL 缓冲液（100x）、0.5 μL BSA（10x）、Spel（0.1 U/uL）和水的 50 uL 单个限制酶切消化物在混匀仪（Eppendorf ThermoMixer® C）中，37℃，培养 2 小时。然后,在80℃，灭活 20 分钟。
将混合物转移到离心柱中，R22A4 转子进行离心（4℃，17,900 xg，1min）。用 0.75 mL PE 缓冲液洗涤 DNA，再次离心（4℃，17,900 x g，1 min）。最后，用 50 μL 水在 4℃，17,900 xg，洗脱 1 分钟。
4. 通过聚合酶链式反应（PCR）添加 poly-（A）尾
设计引物后通过在 PCR 进行扩增，可以使用 poly（A）聚合酶为 mRNA 添加 poly-（A）尾。并将样品储存在 -20℃ 下，用于进一步分析。
5. 体外转录：
使用纯化加尾 PCR 产物作为反应模板，将定制的核糖核苷混合物涡旋并短暂离心。将溶液在PCR仪 （MasterCycler@ X50 Aluminum）中，37°C 下孵育 4 小时。培养后,向样品中加入 2 uL Turbo DNase，并在 37°C 下孵育 15 分钟，纯化 RNA。
6. 电泳
使用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离和检测 mRNA，评估 mRNA 的纯度和完整性。
从细菌培养到体外转录的过程中，每一步对分离样品的要求都在变化，离心机转子的通量和转速也随之发生改变。那么，如何为离心的各个阶段选择合适的转子呢？
作为样本处理专家，Eppendorf 始终致力于在不同阶段为用户实现优异的样本分离效果。在质粒纯化的多步流程中，使用Eppendorf CR22N 高速落地离心机，搭配多种转子，一切离心难题都不在话下！
R9A2 转子-超大容量细菌沉淀
R9A2 转子最多可以容纳4 个 1.5 L 离心瓶。单次运行可以容纳 6 L 培养基，与传统的 6 x 1 L 容量转子相比，处理时间可节省 32%，大幅提高收获效率。
▲R9A2 转子：大口径 1.5 L 三角离心瓶
R15A 转子-高效质粒 DNA 纯化
可同时离心 10 x 15 mL 和 10 x 50 mL锥底管，无需适配器；灵活应对不同样本量与实验需求。
▲R15A 转子
R22A4 转子-满足酶切 & PCR 产物纯化
R22A4 转子最多可容纳 30 根微量离心管,可使用离心柱在 1.5/2 mL 离心管中完成纯化，同时可用于 PCR 产物纯化，提供高质量转录样本。
▲R22A4 转子
高速、稳定、容量大的离心机可以帮助我们更好的实现细菌样本的高通量收获，提升实验效率与结果质量。这款超大容量、多转子灵活应用的高速落地离心机一把搞定！
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内容策划：潘成
内容审核：周育红
题图来源：图虫创意
参考文献
[1]. Chen, H., Liu, D., Guo, J. et al. Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA. Nat Biotechnol (2024). https://doi.org/10.1038/s41587-024-02174-7
[2]. Liu C, Shi Q, Huang X, et al. mRNA-based cancer therapeutics[J]. Nature Reviews Cancer, 2023.
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