撰文丨查理喵子

复制是生命体（life）区分非生命体的重要特征；DNA复制（DNA replication）是生命体完成亲子代遗传信息传递的关键过程。自DNA双螺旋发现以来，科学家通过生物化学、分子生物学、结构生物学和分子动力学模拟等多种技术手段研究DNA复制的机制；这些研究逐步形成了我们对DNA复制的理解。当前教科书的模型将DNA复制过程描述为，一个多蛋白组分相互调控的分子机器，通过精密的协同作用，利用半保留复制的方式实现亲子代遗传信息高效、准确的传递。其中，这一关键分子机器-DNA复制体（DNA replisome）常常被描述为稳定和牢固的。随着研究深入，科学家逐渐认识到在DNA复制过程中遇到的很多阻碍，如DNA断裂（DNA lesions）、碱基错配（nucleotide mismatches）、遇到转录复合体（transcription complex）等，可能会让DNA复制体分子机器打破原有的稳定状态，从而动态地适应生命体遇到的各种挑战【1, 2】。

最近一二十年，随着新技术的革新和实验分辨率的提升，科学家发现在复制体动态适应变化环境时， DNA复制中的关键因子--DNA聚合酶（DNA polymerase）常常会结合-解离-再结合（binding-unbinding-reassociation）DNA；由于复制过程中聚合酶和解旋酶（helicase）保持接触，这一过程也被认为是由解旋酶协助调控【3, 4】。另外，DNA复制过程中会经常出现碱基错配，而DNA聚合酶作为一个双功能蛋白，除了以5' -> 3'端完成DNA复制，与解旋酶保持相同运动方向外（滞后链上的聚合酶通过DNA loop的方式保持相同方向），当聚合酶“感知”到碱基错配时，会通过聚合酶构象转化、“掉头”以3' -> 5'端方向完成DNA错配碱基的校正。为此，三个关键问题被提出：（1）当DNA聚合酶进行碱基错配校正时（3' -> 5'），其移动方向与解旋酶方向相反，这时DNA聚合酶不再与解旋酶接触，其结合-解离-再结合动力学是如何调控的呢？（2）DNA复制需要满足的高保真度（high-fidelity）是如何靠聚合酶“感知”并实现的呢，其分子机制是什么？（3）DNA复制作为生命体最基础、最底层的分子功能，其功能活性为什么要依赖另一个蛋白质？

然而，正如“无法从平均收入中推测个体的收入水平”一样，传统的集群测量方法（ensemble assays）将DNA、蛋白质、盐离子、各种辅助因子按照一定比例放到化学反应容器（如EP管）中，在特定时间点采样观测，得到的观测结果是所有DNA-蛋白质分子相互作用的平均值，掩盖了单个DNA和蛋白酶分子层面的细微、独特运动，因此无法揭示每一个DNA和蛋白质之间的相互作用；此外，之前的荧光成像和力学测量技术分辨率有限，无法捕捉复制叉处聚合酶分子的快速、瞬态交换行为。这些技术限制使得这些科学问题缺乏实时、动态的观测及分子层面的解答。

近日，来自荷兰Vrije Universiteit Amsterdam大学的Gijs Wuite团队（徐龙福博士是第一作者）在Nature Communications发表题为Mapping fast DNA polymerase exchange during replication的研究论文。该研究建立了在DNA复制叉处实时追踪和观测DNA复制动力学的新方法；通过利用高时空分辨率的单分子DNA力学和荧光显微成像技术，在单个DNA分子水平实现了观测复制过程中DNA聚合酶的在复制叉处的快速运动，揭示了DNA聚合酶在复制过程中的快速自主交换模型，该模型解释了DNA聚合酶在保持高效率的同时显著提高复制准确性的分子机制。

如果把柔性的DNA分子比作一根很容易彼此缠绕的细绳，为了实现单分子的研究，一个自然的想法是在绳两端用一定的力拉直（施加力范围在10-50pN，模拟体内DNA受到的作用力）。如果把DNA上运动的聚合酶比作一个个移动的“小人”，为了追踪“小人”的移动，一个想法是给“小人”穿上带“颜色”的衣服。当这些“小人”在DNA绳上移动时，便可以通过荧光显微镜（fluorescence microscope）实时追踪和观测它们的移动，从而计算出复制速率。为了追踪DNA聚合酶结合和解离动力学，作者通过不完全标记的方法，有的“小人”穿带颜色衣服，有的“小人”不穿，从而做到区分，实现在单分子水平上追踪DNA聚合酶结合-解离-再结合的过程。然而，考虑到荧光显微镜存在的衍射极限（diffraction limit，～300 nm），多个“小人”（直径约6nm）的移动轨迹可能会发生重叠，无法准确分辨。如何在单分子水平上、高时空分辨率下观测这一过程仍是重要的技术挑战。

为此，作者首先利用双光镊力谱系统抓取一条DNA绳并施加一定作用力，测量单个DNA分子由于聚合酶复制（pol）或者外切（exo）而产生的DNA端到端距离变化（end-to-end distance）（DNA“绳”的长短变化）。结合已知的单链DNA和双链DNA不同的弹性系数，计算出单链/双链DNA的比例，并进一步计算出连接点（ssDNA/dsDNA Junction）的位置（图1）。考虑到DNA聚合酶只有结合在ssDNA/dsDNA连接点处才可复制/外切，这个连接点便是DNA聚合酶在复制过程中的位置（第一部分，DNA力学数据，来自光镊测量）。同时，利用共聚焦显微镜追踪荧光标记的DNA聚合酶分子（带颜色的“小人”），直接追踪、观测其运动轨迹（第二部分，蛋白质光学数据，来自荧光显微镜）。这样，作者便收集到两种独立的技术同时观测同一个分子的动态过程。考虑到力学数据的高分辨率和光学数据的可视化优势，当把这两种数据进行相关性分析，便可实现在单分子水平上、高分辨率下实时追踪DNA聚合酶的复制过程。当荧光标记的DNA聚合酶从交界点结合或解离时，便会出现荧光强度随时间的变化；通过分析荧光强度的阶梯式增加和减少，推断出荧光DNA聚合酶的结合和解离及转换动力学（图1）。

图1. 相关光镊-荧光技术（correlative tweezer-fluorescence microscopy）实时追踪DNA复制过程的快速交换（A和B）及典型数据及分析方法（C和D）

为研究DNA聚合酶的结合-解离-再结合过程是否依赖解旋酶，作者在实验过程中仅添加DNA聚合酶，排除其他蛋白因子的可能作用。研究发现， DNA聚合酶在ssDNA/dsDNA交界点会快速解离和重新结合，平均结合时间仅1秒左右。重要的是结果发现，DNA聚合酶快速交换并不依赖于之前假设的“解旋酶调控”；在无解旋酶存在时，DNA聚合酶也可自主进行结合-解离-再结合。

但是，这种快速交换的机制带来一个问题：DNA聚合酶是如何维持高效复制的呢？作者观测到，尽管结合时间短，但重新结合的DNA聚合酶往往会保持先前的催化活性状态，而非随机选择功能，作者将此称为“记忆效应” （memory effect） 。例如，之前执行复制的聚合酶在重新结合后仍以较高概率继续发挥复制功能。这一机制有助于维持复制的高效连续性。作者推测这种“记忆效应”可能与ssDNA/dsDNA交界点的构象有关。

此外，作者观测到，每个聚合酶分子在单次结合时，通常只执行单一的催化活性（复制、外切或暂停），而不会在同一结合过程中发挥功能转换。这似乎挑战了先前的假设：“同一聚合酶在遇到错配碱基时“掉头”发挥外切活性（3' -> 5'）移除错配碱基对”。作者解释到，溶液内存在不同构象的DNA聚合酶，这些构象的分布服从热力学定律。当DNA聚合酶进行快速自主交换时，ssDNA/dsDNA的构象可能起到一个“筛选”作用：若未出现错配碱基，DNA聚合酶解离前后的ssDNA/dsDNA构象并未发生变化，所以新结合的DNA聚合酶会由于“记忆效应”保留其原来运动方向、从而维持高连续性；但当出现错配碱基时，ssDNA/dsDNA交界点的构象会出现非Watson-Crick结合而导致扭曲，从而打破“记忆效应”，使得只有反方向移动的聚合酶才可以结合，实现错配碱基校正的作用。

作者指出，该研究是基于简单的T7噬菌体复制系统，但揭示的分子机制对理解复杂真核生物DNA复制过程将有重要启示意义。同时，这一技术分析手段，对于探究DNA聚合酶与其他蛋白相互作用，以及其他在ssDNA/dsDNA交界点的蛋白具有非常好的帮助。

综上，该研究开发了在单DNA分子水平上实时追踪和观测DNA复制叉处DNA复制动力学的新方法；并根据新技术手段的研究成果，作者提出了一种去中心化的DNA复制模型：在该模型中，DNA聚合酶以高频率自主交换的方式在DNA分子上运动，每次结合时只执行单一功能，但由于"记忆效应"而显现出高效连续的复制过程。DNA聚合酶的自主的快速交换行为，或许是细胞进化出的一种策略，使其能够更好应对复杂环境中的干扰 （如另一种蛋白功能受限） ，从而确保复制的高效性和准确性。

参考文献

1. Heller, R. C. & Marians, K. J. Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.Nature439, 557–562 (2006).

2. Loparo, J. J., Kulczyk, A. W., Richardson, C. C. & Van Oijen, A. M. Simultaneous single-molecule measurements of phage T7 replisome composition and function reveal the mechanism of polymerase exchange.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America108, 3584–3589 (2011).

3. Johnson, D. E., Takahashi, M., Hamdan, S. M., Lee, S.-J. & Richardson, C. C. Exchange of DNA polymerases at the replication fork of bacteriophage T7.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.104, 5312–5317 (2007).

4. Hamdan, S. M. et al. Dynamic DNA helicase-DNA polymerase interactions assure processive replication fork movement. Mol Cell27, 539–549 (2007).

https://www.nature.com/articles/s41467-024-49612-3