案例解析｜2025 国自然标书申报策略及撰写技巧|免疫|国自然|撰写技巧|炎症|特异性|申报策略|科学|细胞|自然标书

国自然申报系列讲座第二场

为帮助广大科研工作者掌握撰写国自然申请书的关键技巧，丁香通联合青椒医学将于 2024 年 7 月 3 日 19:00 为大家带来主题--「2025 国自然标书申报策略及撰写技巧」，点击下方「预约」即可快速报名。

课程要点：
1、2025 年国自然申报趋势
2、国自然中标要素：本子、底子、圈子
3、2025 年国自然热点分析和思路设计建议
4、标书写作技巧及利用 ChatGPT 提升本子质量

案例解析

DNA 甲基化逐渐成为国家自然科学基金的热点话题，本期我们将以一个 2023 年成功中标的项目为例，详细解析申请书的撰写要点。

项目研究思路分析

DNA 甲基化：DNA 甲基化是一种表观遗传修饰，通常发生在胞嘧啶上，特别是 CpG 岛区域。DNA 甲基化在基因表达调控、细胞分化以及染色体稳定性等生物学过程中起着重要作用。在疾病状态下，DNA 甲基化模式的改变可能导致异常的基因表达。DNA 甲基转移酶家族 DNMTs 如 DNMT1 通常参与 DNA 甲基化过程。

PCSK6：PCSK6 是一个编码丝氨酸蛋白酶的基因，这类蛋白负责蛋白质前体的裁剪，使其成为活性形式。在多种生物学过程中，如发育和信号传导中，PCSK6 都可能扮演重要角色。

MAPK 通路：MAPK 通路（丝裂原活化蛋白激酶通路）是一种重要的信号转导通路，涉及多种细胞功能，包括增殖、分化、迁移和凋亡。MAPK 通路由多种蛋白激酶级联反应组成，包括 ERK、JNK 和 p38MAPK 等。

儿童哮喘：哮喘是一种慢性炎症性呼吸道疾病，特点是气道高反应性和可逆性气道阻塞。在儿童中，哮喘可能由遗传、环境因素以及免疫系统反应共同作用引发。

在此研究中，可能关注的信号轴是 DNA 甲基化调控 PCSK6 的表达，并通过 MAPK 通路影响细胞行为，进一步影响儿童哮喘的发生和发展。具体的调控机制可能包括：

DNA 甲基化调控 PCSK6：甲基化水平的改变可能导致 PCSK6 基因启动子区域的转录活性变化，从而影响 PCSK6 蛋白的表达水平。高或低的 PCSK6 表达可能改变其下游蛋白的活化状态。

PCSK6 通过 MAPK 通路的作用：PCSK6 可能直接或间接影响 MAPK 通路中的某个或某些成员的活性，进而调控细胞的增殖、分化等过程。

MAPK 通路在儿童哮喘中的角色：MAPK 通路的激活可能导致炎症细胞因子的产生，增加气道炎症和反应性，从而在哮喘发病机制中发挥核心作用。

基于上述分析结果，本项目的思路大致为 DNMT1 上调 PCSK6 基因甲基化水平，促进其表达，进而激活 MAPK 通路，诱发炎症，导致儿童哮喘。

项目写作（穿插写作思路讲解）

摘要

摘要撰写时注意其包括以下几个部分：

1）疾病研究的问题（提出问题）；

2）目前研究热点（问题切入）；

3）预实验数据（提出假设的依据）；

4）提出假设（根据研究热点和预实验数据，提出自己的科学假说，一句话）；

5）拟进行研究（研究内容的缩写，打算怎么证明或验证假设）；

6）研究意义。同时撰写时严格把控字符数，400 以内

根据以上几个要素，这里我们的摘要可以写为：

儿童哮喘是一种常见的慢性炎症性肺部疾病，给患儿及其家庭带来严重影响，迫切需要新的治疗方法。目前对 DNMT1 在哮喘发病中的作用及其通过 PCSK6 影响 MAPK 通路的机制研究尚不充分，需要进一步探索。我们的前期实验显示，DNMT1上调可增加 PCSK6 基因的甲基化水平，进而促进其表达。此外，体外实验证实 MAPK 通路活化与炎症反应的加剧直接相关。

因此，我们提出假设：DNMT1 上调 PCSK6 基因甲基化水平，促进其表达，激活 MAPK 通路，诱发炎症，导致儿童哮喘。在组织样本水平、体内、体外和分子水平，借助基因编辑、甲基化特异性 PCR 和免疫荧光染色等技术，明确 DNMT1 的功能作用，阐释其通过 PCSK6 激活 MAPK 通路的作用机制，评价其在儿童哮喘治疗中的应用潜力。该项目有助于深入理解儿童哮喘的分子机制，并可能开拓新的治疗策略。

立项依据

立项依据的撰写主要包括几个部分：

1）你要研究什么？即临床问题

2）研究的意义是什么？

3）目前的国内外研究有哪些缺陷，哪些问题，从何处入手？

4）我们在前期工作中发现了什么，即预实验，为什么我来研究这个问题最合适以及为何产生此假说？即阐明假说形成的思路过程。

5）凝练出本课题的关键科学问题，提出「研究假说」。简要说明你的研究思路。

国自然基金重在科学假说的创新性、合理性、明确性、逻辑性、科学性、完善性，缺一不可。但是点到为止，既要证明该假说的合理，又不能把所有的实验都做完，是一个拼图游戏，所以这里面分子机制的实验数据列举需要有个度，预实验达到总研究内容的 30% 左右为宜。

在撰写立项依据时，参考文献也需要注意以下几点：

1）选择权威和有影响力的文献；

2）引用最新的研究成果：近 3 年，不可引用太老的文章，且需引用几篇申请当年发表的文献；

3）引用适量的文献：在立项依据中，不要过度引用文献，也不要过于依赖文献堆砌，青年、地区 30 篇左右，面上 40 篇左右即可。

此外，一个好的小标题能让专家在短时间内更直观地明确你的内容，所以写好立项依据的小标题能给人留下好的第一印象，非常重要。

在这里，我们可以写做：

1.1 儿童哮喘的病理特性及其社会经济负担

这部分将阐述儿童哮喘的临床特征，包括常见症状、发作触发因素以及疾病进程，并详细讨论其对患者生活质量的影响和社会经济方面的负担，如治疗成本和工作/学习效率的降低。

1.2 PCSK6 上调引发炎症并导致哮喘发生

在这一部分中，阐述 PCSK6 蛋白在儿童哮喘病理状态下的表达水平如何增加，并导致炎症反应的加剧，进而触发或恶化哮喘症状的具体机制和证据。

1.3 PCSK6 表达上调激活 MAPK 信号通路

这部分内容将描述 PCSK6 如何通过激活 MAPK 信号通路来发挥其生物学功能，包括 MAPK 通路在细胞信号转导中的关键作用以及它如何调节免疫反应和炎症过程。

1.4 DNMT1 上调导致 PCSK6 基因甲基化水平增加

这里将讨论 DNMT1 蛋白的上调如何导致 PCSK6 基因的甲基化状态改变，包括甲基化在基因表达调控中的角色以及这一改变如何影响 PCSK6 的表达和功能。

1.5 本项目的科学假说和后续研究计划

最后，将明确阐述本研究的核心科学假说，并概述计划采取的实验设计和方法，以验证假说的正确性，并探索其在儿童哮喘治疗中的潜在应用

研究目标

研究目标的撰写注意以下几点

1）目标清晰，层次分明，只写目标，不用再重复研究意义、用什么方法研究，且目标具体，可实现。

2）突出科学性。

3）内容详尽，覆盖到所有的拟解决的科学问题。

可按照明确……关系；揭示……规律；理解……作用；阐明……机制等的模板撰写

以本项目为例，研究目标可写做：

1.明确 DNMT1 对 PCSK6 基因甲基化水平的调控关系

旨在通过详细分析 DNMT1 的表达水平如何影响 PCSK6 基因的甲基化状态，从而探索这两者之间的直接调控关系。

2.揭示 PCSK6 表达激活 MAPK 通路的分子机制

本目标聚焦于阐释 PCSK6 如何通过提高其蛋白表达来激活 MAPK 信号通路，从分子层面解析这一过程的具体步骤和关键调控点。

3.理解激活的 MAPK 通路如何诱发炎症反应并加剧儿童哮喘

这一目标将探讨 MAPK 通路在炎症反应中的角色以及其如何通过调节下游因子影响哮喘的病理过程，为儿童哮喘的防治提供新的视角。

研究内容

研究内容的撰写需注意是为了达成研究目标而要去做的研究，与研究目标呼应，为具体研究方案的框架，撰写过程中可按照临床样本、动物水平、细胞水平分层次撰写，阐明做什么事达成什么目的。同时明确细胞、动物模型的选择和构建

那么，该如何撰写呢？我们这里以图文的形式为大家展现（注意，这里的配图仅是为了大家直观地理解研究内容的写作，并非是技术路线图，实际的标书中研究内容部分并不需要该图）

1.临床研究部分

通过收集儿童哮喘患者和健康对照组各 50 例的血液和支气管肺泡灌洗液样本，将运用免疫组化（IHC）和 Western blot 技术检测 DNMT1 和 PCSK6 的蛋白表达水平，并使用定量实时 PCR（qRT-PCR）技术评估这些基因的表达。重点使用 DNA 甲基化敏感性 PCR（MSP）来评估 DNMT1 对 PCSK6 基因启动子区域甲基化水平的影响，结合免疫荧光技术观察 MAPK 通路的活化情况。此外，将通过测量炎症相关细胞因子如 IL-6 和 TNF-α 的水平，探讨这些分子标记物与哮喘严重度之间的关联，从而评估它们在儿童哮喘中的诊断和预后评估价值。

2.动物实验部分

将构建 PCSK6 基因敲除的转基因小鼠模型，使用 CRISPR/Cas9 技术实现基因编辑。小鼠分为四组：野生型对照组、PCSK6 敲除组，每组至少 20 只。通过进行肺功能测试来评估哮喘表型的变化，如气道阻力和顺应性的改变。结合免疫荧光和 TUNEL 染色技术检测气道炎症和细胞死亡情况。使用甲基化特异性 PCR（MSP）评估 DNMT1 对 PCSK6 甲基化状态的调控以及其对哮喘发展的影响。通过ELISA测定血清中的炎症因子（如 IL-5, IL-13, IgE）以反映哮喘症状的严重程度。

3.细胞实验部分

选择人支气管上皮细胞（BEAS-2B）和人肺成纤维细胞（MRC-5）作为模型，通过 CRISPR/Cas9 技术特异性敲除或过表达 DNMT1 和 PCSK6。细胞分为对照组、DNMT1 过表达组、PCSK6 敲除组及 DNMT1 过表达 +PCSK6 敲除的挽救实验组。运用免疫共沉淀（Co-IP）、EdU 增殖检测及 Annexin V/PI 染色等技术，评估基因编辑后的细胞在 MAPK 通路活化状态下的增殖和凋亡表型。使用甲基化特异性 PCR 检测基因甲基化状态的变化及其对 PCSK6 表达和功能的影响。ELISA 和流式细胞术测定气道炎症介质（IL-6, IL-8, TNF-α）和细胞黏附分子的表达

4.分子机制探索部分

利用质谱分析和蛋白质组学技术深入探索 DNMT1 和 PCSK6 之间的分子相互作用及其对 MAPK 通路成分的直接影响。结合 ChIP-Seq 分析 DNMT1 对 PCSK6 启动子区域的甲基化状态，揭示其上调 PCSK6 表达的表观遗传机制。同时，运用实时活细胞成像技术监测 MAPK 通路活化对细胞行为的影响，进一步理解其在细胞行为中的作用机制，以实现从分子到细胞再到组织和整体的多层面研究。

拟解决的科学问题

关键科学问题的撰写需要凝练出本项目的重点难点问题，同时与研究目标、研究内容相呼应，使得研究目标就是去解决这个问题，而研究内容就是解决这个问题的方式。撰写中在提出科学问题之后还要解释一下为什么这是关键科学问题；并给出解决方案，如何去解决这个问题。

在青年、地区项目中，关键科学问题通常写 2 个即可，面上则撰写 3 个为宜。

具体如何撰写呢？

1.明确 DNMT1 如何通过调控 PCSK6 基因的甲基化水平促进其表达是本项目拟解决的关键科学问题之一。

DNMT1 的甲基化调控作用在基因表达的表观遗传层面至关重要，尤其是在病理状态下。明确这一过程可以帮助我们理解哮喘等疾病的分子基础，并可能指向新的治疗靶点。本项目拟通过 ChIP-Seq 实验确定 DNMT1 在 PCSK6 启动子区域的结合位点，通过甲基化特异性 PCR 和 qRT-PCR 实验评估这些位点的甲基化状态与 PCSK6 mRNA 表达水平之间的关系，证实 DNMT1 调控 PCSK6 表达的机制。

2.明确激活的 MAPK 通路如何诱导炎症反应并加剧哮喘症状是本项目拟解决的关键科学问题之一。

MAPK 通路是调控细胞应答的关键信号通路之一，其在炎症和哮喘中的作用尚未被完全明了。解析这一通路如何促进炎症反应将为疾病治疗提供新的靶点。本项目拟通过免疫共沉淀实验检测 MAPK 通路关键蛋白的激活状态，通过流式细胞术和 ELISA 实验评估激活状态下细胞释放的炎症介质，证实 MAPK 通路在诱导哮喘炎症反应中的作用。

国自然申报系列讲座第二场

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