研究介绍
研究背景
Background
人为造成的气候变化变成了二十一世纪最紧急的问题之一。温室气体二氧化碳或者甲烷可以被用来合成绿色甲醇。过去十年已经有很多工作把大肠杆菌作为合成的甲基营养菌，但是它们利用甲醇用于生物转化的工程应用还没有被展现出来。
研究目的
Aim
研究方法
1、连续稀释进化被用来提高甲基营养生长。
2、基因组重测序菌落样本发现重复发生的突变。
3、通量平衡分析（parsimonious flux balance analysis; pFBA）用来预测长期适应性进化的大肠杆菌的通量平衡。
4、蛋白的表达与纯化；体外酶活测定检测突变体酶的活性变化。
5、产物的定量测定：LC/MS测定乳酸和衣康酸的3-硝基苯腙衍生物以及PABA；GC/FID测定甲醇分解的PHB。
研究发现
1. 倍增时间约为4.3h的甲基营养大肠杆菌
作者在之前的研究报道了大肠杆菌的甲基营养生长：恒化连续培养约250代后进化出一种合成的甲基营养大肠杆菌，一个生长更好的甲基营养标准菌株 MEcoli_ref_1 在255代进化之后被分离出来，其倍增时间约为8.1h。 在本研究中作者希望继续通过连续稀释进化来提高它们的生长，在初始甲基营养菌分成的重复菌株D、E、F和G进行1200多代进化后，作者分离出单个克隆，测量它们的生长速率。其中一个新的标准菌株 MEcoli_ref_2从D中被分离出来，倍增时间约为4.3h（图1a）。
图1MEcoli_ref_2的生长及其遗传适应性
2.MEcoli_ref_2 依赖甲醇更快生长的适应性
接下来他们想要理解MEcoli_ref_2生长更好的遗传和生理适应因素，为了发现促进甲基营养生长相关的变异，他们进行基因组重测序并发现了重复突变的位点。他们发现甲醇氧化、核酮糖单磷酸（RuMP）循环、丙酮酸代谢被反复击中（图1c,d）。甲醇氧化是由两个甲醇脱氢酶（mdh）的遗传变化和含甲醇脱氢酶的质粒的基因间区域变异被靶向的。RuMP循环中的基因突变是在6-磷酸己酮糖合酶和6-磷酸己酮糖异构酶（hps-phi）的操纵子的启动子区域和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因（gnd）。作者用pFBA预测，结果最佳生长时通过Gnd催化的反应几乎没有通量（图1d）。于是作者用体外酶活测定实验验证了MEcoli_ref_2的突变体Gnd(E282*)的酶活与野生型相比大幅减少（图2d）。预测的生长对Gnd的高活性具有敏感性以及重复的功能缺失突变的固定表明这个反应失调与健康状况下降相关。有三个突变影响了丙酮酸节点，分别发生在丙酮酸激酶2（pykA），丙酮酸激酶1（pykF）和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶调节蛋白（ppsR）（图1c）。作者之前发现MEcoli_ref_1中碳进入TCA循环是通过一个羧化反应，这和作者的pFBA分析一致（图1d）。为了避免无效循环，从丙酮酸到磷酸烯醇式丙酮酸的逆反应是不能够流通的（图1d）。和这个一致，作者发现pyKA和pyKF在所有重复菌株中发生了几个独立的无义突变和错义突变。体外酶活测定证实了MEcoli_ref_2的PyKA或PyKF的突变体功能缺失（图2e,f）。总的来说，多于1200代的进化调整了丙酮酸代谢来防止无效循环。
图2体外鉴别突变体酶
3. 产生来自甲醇的增值化合物
接下来作者的目标是探究MEcoli_ref_2转化甲醇为增值产物的潜力。他们选了四个化合物作为靶点：来自丙酮酸的乳酸，来自乙酰辅酶A的聚羟基丁酸酯（PHB），来自TCA循环的衣康酸和来自分支酸途径的对氨基苯甲酸（PABA）（图3a）。PABA是一种芳香烃，是化学工业中的一种关键中间物，另外三种化合物是用来产生有着巨大的市场的生物塑料。以乳酸的生产为例，作者将来源于Streptococcus bovis的L-乳酸脱氢酶基因克隆到表达质粒中，转入到含500mM甲醇基础培养基的MEcoli_ref_2中，产生乳酸284.0 ± 23.6 mg/l（mean ± s.d.; 图3b,f）， 而空白质粒作为阴性对照没有检测到可量化的乳酸。甲醇是这个培养基中的唯一碳源，表明乳酸是由甲醇产生的。为了排除不明碳源导致乳酸的产生，作者用相同的培养条件，用13C标记了甲醇。
图3甲醇被生物转化为四种不同的产物
4. 高细胞密度培养提高产量
经济的工业生产过程需要高的细胞密度来达到高的空间时间产率。作者按照标准的生物反应器流程在批量进料条件下在生物反应器中培养MEcoli_ref_2。作者将含表达顺式乌头酸脱羧酶基因（cadA）的质粒转入MEcoli_ref_2生长到OD600值为46，然后诱导酶的表达来产生衣康酸，导致与摇瓶相比，衣康酸的浓度高大约7倍1.0 g /l (7.7 mM)，生产率提高了8倍15.0 mg l-1·h-1（图4b,c）。
图4高细胞密度培养提高衣康酸生产
研究讨论
从在生物反应器条件下观察到的MEcoli_ref_2的表现来看，作者认为合成的甲基营养大肠杆菌可以适用于精密发酵工艺。事实上乳酸、衣康酸、PABA、PHB之前已被发现可以由其他生物产生。这里合成的甲基营养大肠杆菌作为一种新的模式生物用于转化甲醇，从经济可行的角度来看，浓度、产量和效率还需要大幅提高。未来工作会是优化生产途径并提高生物反应器内的高细胞密度培养，使经济的生物工艺成为可能。未来还需要去鉴定大肠杆菌依赖甲醇生长的确切的遗传组成和依赖甲醇的更快生长的因素。
总结
研究意义
在这个研究中作者制作出了合成甲基营养菌参考菌株MEcoli_ref_2，产生出了乳酸、PHB、衣康酸和PABA，这种甲基营养菌在批量进料生物反应器中培养与摇瓶相比衣康酸的产量更高。本研究为利用合成的甲基营养大肠杆菌应用于未来工业的甲醇生物转化奠定了基础，为温室气体转化成增值化学物质提供了机会。
参考文献
[1] Reiter, M.A., Bradley, T., Büchel, L.A., Philipp, K., Emese, H., Thomas, G. and Julia, A.V. (2024). A synthetic methylotrophic Escherichia coli as a chassis for bioproduction from methanol. Nat Catal 7, 560–573. https://doi.org/10.1038/s41929-024-01137-0
文案 | 林夕
排版 | 林夕
审核 | 林夕
发布｜姜笑南
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