导读
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种常见的慢性肝病，目前治疗方案很少。中医药应用数千年，以其“多组分、多靶点、多途径”的特点，在治疗此类复杂疾病方面表现出显著优势。复方首乌降脂颗粒（CSJG）是治疗NAFLD的临床经验方，但其药理机制尚不清楚。通过比较CSJG治疗前后的血液生物标志物水平和肝脏磁共振（MR）图像，本研究回顾性分析了CSJG在NAFLD患者中的临床疗效；然后，使用高脂肪/高果糖（HFHF）饮食诱导的NAFLD小鼠，通过肝脏脂质测定和肝脏样品的组织病理学染色，进一步证实CSJG对肝脏脂质积聚的作用；接下来，我们通过测定CSJG的成分，并进行网络药理学分析以预测CSJG潜在的靶点，定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹进行验证；并从三酰甘油酯（TAG）合成而非游离脂肪酸（FFA）合成的角度，进行脂质组学研究，进一步探讨CSJG抗NAFLD的机制；还采用qPCR和蛋白质免疫印迹分析参与该过程的酶，以及通过分子对接分析了TAG合成的关键酶与CSJG活性成分之间的潜在相互作用。结果发现，CSJG降低了NAFLD患者和小鼠的血脂水平和肝脏脂肪积聚。虽然网络药理学分析揭示了FFA的合成途径，但CSJG仅对其产生轻微影响。通过脂质组学分析，本研究发现GSJG可显著阻断肝脏中甘油二酯（DAGs）和TAGs的合成，降低DGAT2和增加PLD1蛋白的表达，从而将DAGs从TAGs合成途径转移到磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酸（PA）的产生，从而降低TAGs水平。分子对接表明，大黄酸、木犀草素和甘草素可能参与了这一调控。临床和实验证据表明，CSJG是一种潜在的治疗NAFLD的药物。CSJG调节TAGs的合成以减轻肝脏脂质积聚。其中，来自CSJG的大黄酸、木犀草素和甘草素可能在其中起重要作用。
研究亮点：
1. 复方首乌降脂颗粒对NAFLD患者和小鼠的缓解作用；
2. CSJG适度调节网络药理学预测的FFAs合成；
3. CSJG显著调节TAGs的合成，从而降低肝脏中TAGs的水平。
论文ID
原名：Compound Shouwu Jiangzhi Granule regulates triacylglyceride synthesis to alleviate hepatic lipid accumulation
译名：复方首乌降脂颗粒调节甘油三酯合成，减轻肝脏脂质堆积
期刊：Phytomedicine
IF：6.7
发表时间：2024.04
通讯作者：张经纬&王琳&王广基
通讯作者单位：中国药科大学，烟台大学
实验设计
实验结果
1. CSJG改善NAFLD患者的血脂异常和肝脏脂肪积聚
在中医理论中，NAFLD被描述为肝、脾、肾功能紊乱、痰浊血瘀。在此基础上，科研学者等研制出补肾排浊、补脾化痰、散瘀散积的中药复方CSJG，以治疗NAFLD。我们对36例NAFLD患者服用CSJG前后各项指标进行回顾性分析。如图1A所示，CSJG给药后，血清中的甘油三酯（TG）、总胆固醇（T-CHO）和低密度脂蛋白（LDL）均显著降低，磁共振质子密度脂肪分数（MRI-PDFF）评估的脂肪变性程度也显著降低（图1C～D）。肝功能指标（AST和ALT）没有显著变化（图1B）。这些结果表明，CSJG在临床上可以改善肝脏脂肪堆积，减缓NAFLD。
图1 CSJG可改善NAFLD患者的血脂异常和肝脏脂肪积聚。（A）服用CSJG前后患者（n=36）血清中的TG、T-CHO、LDL-C和HDL-C水平，（B）ALT和AST水平。（C）14名患者的肝脏MRI-PDFF的代表性图像，以及（D）它们的定量。统计分析采用配对t检验和非参数分析。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。CSJG：复方首乌降脂颗粒；NAFLD：非酒精性脂肪肝；TG：三酰甘油酯；T-CHO：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶。
2. CSJG缓解HFHF饮食诱导的小鼠NAFLD
我们通过给雄性C57BL/6J小鼠喂食HFHF饮食20周来构建NAFLD模型（图2A）。如图2B所示，与对照组相比，20周的HFHF喂养导致体重、肝脏重量和腹部脂肪重量的增加更大。CSJG给药16周后，这些参数显著降低。在HFHF诱导的NAFLD小鼠中，血清T-CHO和LDL-C也显著增加，CSJG显著降低了血清T-CHO和LDL-C的水平（图2C）。肝脏脂质蓄积是诊断NAFLD的金标准。与稳定的血清TG水平相比，NAFLD小鼠肝脏中的TG水平是对照小鼠的2.3倍，CSJG处理逆转了这种增加，其程度与阳性对照水飞蓟宾相似（图2D）。组织学染色显示，CSJG以剂量依赖的方式减轻了HFHF诱导的肝损伤（H&E）和脂滴积聚（油红色）（图2E）。所有这些结果表明，CSJG对HFHF诱导的NAFLD具有有效的缓解作用。
图2 CSJG减轻了HFHF饮食诱导的小鼠NAFLD。（A）实验设计。（B） 20周内体重变化以及最终肝脏重量和腹部脂肪重量。（C）血清ALT、AST、TG、T-CHO、LDL-C和HDL-C水平，不使用或使用GSJG处理。（D）不使用或使用GSJG处理的肝脏TG和T-CHO水平。（E）未经或经GSJG处理的小鼠的肝脏代表性图像，用H&E或油红O在未经或有GSJG处理的小鼠中染色（200×，bar = 50µm）。所有数据均显示为平均值±S.E.（n = 8）。采用单因素方差分析进行统计分析。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0. 001。HFHF：高脂肪/高果糖；H&E：苏木精和伊红。
3. CSJG适度调节游离脂肪酸的代谢和积累
我们通过网络药理学方法构建了“成分-靶点-疾病”网络（图S1）。结果预测参与NAFLD脂质代谢并可能干扰CSJG的基因主要富集在FFA代谢中，并通过qPCR进行进一步分析。FFAs是脂质合成的必需材料。它们通过从血浆中摄取（FATPs、CD36）或从肝脏中的乙酰辅酶A从头合成（由ACC、FASN、SCD1催化并由SREBP1C、PPARγ调节）获得，并通过β-氧化（由PPARα、Acsl1和Cpt1调节）消除。如图3A-C所示，HFHF诱导的NAFLD小鼠Fasn、Srebp1C、Scd1、CD36、Pparγ和Acsl1的基因表达显著高于对照组，而Pparα和Cpt1的表达低于对照组。CSJG处理仅适度降低Fasn、Cd36、Pparγ和Fatp4的表达，并增加Cpt1和Pparα的表达。此外，尽管在NAFLD小鼠中ApoB、ApoC、Ldlr和Mttp的表达没有改变，但CSJG显示出ApoC和Ldlr的一些改变（图3D）。然而，NAFLD小鼠仅表现出PPARγ的显著增加，并且CSJG仅在蛋白质水平上抑制ApoC3的表达（图3E～F）。同时，我们在NAFLD小鼠中观察到肝脏FFA的积累，如FFA（16:1）、FFA（18:1）、FF（20:1）、FFT（20:2）和FFA（20:3）。然而，CSJG仅非常显著地降低了FFA（16:1）（图3G）。这些结果表明，CSJG治疗NAFLD可能涉及其他步骤。
图3 HFHF诱导和CSJG治疗对C57BL/6J小鼠FFAs代谢的调节。肝脏中参与FFAs合成（A）、摄取（B）、氧化（C）和脂质运输（D）的基因的相对mRNA水平。进一步测定其中一些酶的（E）蛋白质表达（5个代表性样品）和（F）它们的定量。（G）喂食HFHF饮食或用CSJG处理的小鼠肝脏中的FFAs水平（n = 8）。采用单因素方差分析进行统计分析。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。FFAs：游离脂肪酸。
4. CSJG对NAFLD小鼠肝脏脂质紊乱的修复作用
为了探索CSJG代谢调控的潜在步骤，我们采用LC-Q/TOF-MS在正离子和负离子模式下进行了脂质组学研究。我们在小鼠肝脏中共鉴定出740种脂质，包括209种TAG、127种PE、64种磷脂酰甘油（PG）、60种PC、51种磷脂酰肌醇（PI）、50种磷脂酸（PA）、47种磷脂酰丝氨酸（PS）、40种甘油二酯（DAG）、16种溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、16种溶血磷脂酰胆碱（LPC）、14种溶血磷脂酰（LPG）、11种溶血磷脂酰肌醇（LPI）、8种鞘磷脂（SM）、7种胆固醇脂质（CE）、2种神经酰胺（CER）和1种磷脂酰丝氨酸（PS）。PLS-DA分析显示，对照组、模型、低剂量和高剂量CSJG中存在可区分的聚类（图4A）。从对照组与HFHF诱导的NAFLD小鼠和模型组与CSJG处理的小鼠在不同剂量下的脂质火山图来看（图4B），我们分别发现有422、222和270种脂质受到干扰（p<0.05，倍数变化<0.67或>1.5）。低剂量或高剂量CSJG显著恢复了NAFLD小鼠中总共167种异常脂质（图4C），其分为甘油酯（DAGs；TAGs，50.3%）、磷脂（PA；PE；PG；PC；PI，47.9%）、CE（1.2%）和FFAs（0.6%）（图4D）。在HFHF诱导的NAFLD小鼠中，大多数甘油酯过度积累，磷脂代谢似乎受到显著抑制。而且，CSJG干预有效地重新平衡了这些疾病，如热图所示（图4E～F）。
图4 CSJG对HFHF诱导的NAFLD小鼠肝脏脂质异常的改善作用。（A）进行PLS-DA以显示HFHF诱导的NAFLD小鼠的转变，并比较CSJG在不同剂量下的回调作用。（B）对照组与HFHF诱导的NAFLD小鼠以及模型组与CSJG处理的小鼠的脂质火山图。（C）四个实验组的维恩图。（D）与CSJG干预NAFLD小鼠相关的脂质数量和不同脂质种类的百分比。主要差异甘油酯（E）和磷脂（F）的热图。PLS-DA：偏最小二乘判别分析。
5. CSJG显著阻断TAGs合成，促进DAGs转移
DAGs和TAGs是最常见的甘油酯，是NAFLD的主要诱导剂，并与肝脏中的磷脂相互转化（图5A）。如图5B所示，在NAFLD小鼠中，Dgat基因表达显著上调，形成过量的TAGs，而CSJG极大地逆转了Dgat的这种上调，并降低了Liplin的基因表达。高剂量CSJG甚至能够增加Pld1、Plcγ1和Cept1的基因表达，这有效地促进了DAG的消耗以产生PE和PC。这些结果在蛋白质水平上得到了进一步的部分证实，CSJG增加了PLD1，减少了DGAT2（图5C～D）。与CSJG抗NAFLD作用相关的差异甘油酯和磷脂（VIP>1）如图5E～F所示。CSJG显著逆转HFHF诱导的NAFLD小鼠肝脏中DAGs、TAGs和磷脂的紊乱。
图5 在HFHF饮食诱导的NAFLD小鼠中，NAFLD和CSJG调节TAGs合成的潜在因素。（A）TAGs生物合成和DAGs代谢的主要途径。（B）甘油酯和磷脂相互转化相关基因的表达。进一步测定其中一些酶的（C）蛋白质表达（5个代表性样品）和（D）它们的定量。NAFLD发生和治疗过程中代表性甘油酯（E）和磷脂（F）的变化。统计分析采用单因素方差分析。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。TAGs：三酰甘油酯；DAGs：甘油二酯。
我们对TAG合成的这些关键酶与CSJG的活性成分进行了进一步的分子对接（图6A）。PLD1和DGAT2对儿茶素没食子酸和大黄酸表现出高亲和力，而CEPT1和LIPIN2对儿黄素没食子酸盐、甘草素和木犀草素表现出高亲和性（图6B）。考虑到血浆检测（图S2），大黄酸、甘草素和木犀草素可能在体内发挥作用（图6C）。
图6 CSJG的活性成分与TAGs合成中关键酶的蛋白质的分子对接。（A）CSJG的13种活性成分与参与TAGs合成的6种蛋白质的结合能。（B）蛋白质-成分复合物的三维结构，结合能低于-8.5 kcal/mol，每个靶点排名前两位的蛋白质。（C）来自（B）的除儿茶素没食子酸以外的蛋白质-成分-复合物的二维结构。
NAFLD是全球最常见的慢性肝病，其特征是肝脏中TG积累过多，并与肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常和炎症性疾病有关。由于其复杂的致病机制，目前尚无有效的抗NAFLD治疗方法。中药通过调节脂质代谢和保护肝功能，对NAFLD有独特的治疗作用。尽管CSJG在减少脂质沉积方面具有良好的疗效，在治疗NAFLD方面具有巨大的潜力，但从现代药理学的角度来看，其机制尚未得到证实。
网络药理学分析是中医药机制研究的常用方法，它是基于有文献记载的化合物靶点和已报道的疾病靶点。当不同的化合物聚集在一个中药处方中时，可以根据经验预测处方的靶点。当建立CSJG治疗NAFLD的“成分-靶点-疾病”网络时，脂质，尤其是FFAs代谢相关基因被预测为潜在靶点。循环血浆中游离脂肪酸摄取增加、肝脏新生脂肪生成率高和脂肪酸氧化显著减少被认为是脂质积聚的三种主要途径。然而，在HFHF诱导的NAFLD小鼠中，CSJG仅显著增加了5种FFAs，且仅显著减少了棕榈油酸（FFA16:1）（p<0.05，倍数变化<0.67）。qPCR和蛋白质印迹分析也表明CSJG对FFAs代谢的影响较弱。如图3所示，NAFLD小鼠的Fasn、Srebp1c、Scd1、Cd36、Pparγ、Acsl1的基因表达升高，而Pparα、Cpt1的基因表达降低。然而，高剂量的CSJG不影响上述任何基因。低剂量的CSJG可以逆转其中的一些（Fasn、Cd36、Pparγ、Fatp4、Pparaα、Cpt1）。此外，低剂量的CSJG下调Fatp4和ApoC3，这在NAFLD小鼠中最初没有改变。大剂量CSJG使Ldlr升高，ApoC3降低，模型组Ldlr和ApoC3的表达也无明显变化。然而，当通过蛋白质水平的蛋白质印迹法测定PPARα、PPARγ、LDLR和CPT1时，我们发现CSJG根本不影响这些蛋白质。高剂量CSJG可降低APCOC3蛋白的表达。总之，这些发现原则上可能归因于网络药理学分析的局限性。这个数据库是基于已知的。该预测只是对不同成分的已报道药理学靶标的重组。因此，我们使用系统生物学策略来确定潜在的未知机制：肝脏的脂质组学，因为脂质代谢失衡是NAFLD的主要特征。脂质组学结果表明，HFHF诱导的NAFLD引起了脂质谱的显著变化，CSJG处理对这种变化有明显的回调作用，尤其是对甘油和磷脂。因此，PAs转化为TAGs被认为更有助于CSJG抑制肝脏TAG积累，这可能是CSJG改善NAFLD的潜在途径和机制。随后，在NAFLD小鼠中，大多数参与该途径的基因（Agpat2、Lipin、Cept1、Dgat、Plcγ1和Pld1）以及Pld1和DGAT2蛋白被CSJG显著调节。
PAs、PE和PGs是CSJG抑制NAFLD小鼠DAGs和TAGs的三种主要磷脂。PAs水平的升高可能归因于CSJG对DGAT的抑制和对PLD1的诱导。升高的PA已被证明可促进细胞增殖，促进肝再生以对抗肝损伤。PC和PE是哺乳动物细胞中最丰富的磷脂，PC和/或PE含量的变化与动脉粥样硬化、胰岛素抵抗和肥胖等代谢紊乱有关。如前所述，小鼠PE的减少导致线粒体异常，并导致胚胎死亡。据报道，PE合成受损的个体也会出现脂肪变性，肝细胞TAG合成增加10倍。PGs和PIs是PA的下游代谢产物。PGs在线粒体的结构和功能中起着重要作用，也被报道通过抑制Toll样受体的激活来减少炎症信号。除了胰岛素抵抗外，PIs还调节膜动力学和信号转导途径，PIs的代谢紊乱被认为是NAFLD的另一个常见风险因素。在HFHF诱导的NAFLD小鼠中，CSJG调节DAGs的多向代谢，不仅有助于降低NAFLD所增加的甘油酯（DAGs和TAGs），而且有助于提高NAFLD所降低的磷脂（PA、PE、PG和PI），从而有利于CSJG通过多途径改善NAFLD。这种作用可部分归因于CSJG中的大黄酸、甘草素和木犀草素。
结论
在本研究中，我们研究了CSJG对NAFLD患者和小鼠的疗效。FFAs合成不是CSJG的主要靶点。通过qPCR脂质组学分析和蛋白质印迹证实，CSJG的抗NAFLD作用主要归因于TAGs合成的调节，DGAT2表达减少，PLD1表达增加，从而降低了肝脏中TAGs的水平。总的来说，这些结果表明CSJG在临床上是一种潜在的NAFLD治疗候选药物。
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0944711324003507#abs0001
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