骨骼长期修复与单独修复软骨相比，拥有效果好，恶化少等优点。构建多因子、空间定向的骨软骨支架刺激晚期骨软骨再生具有重要意义。在此，靶向药物,即kartogenin@polydopamine（KGN@PDA）用于软骨修复的纳米颗粒和miRNA@calcium磷酸盐(miRNA@CaP)用于骨再生的NPs是原位沉积在图像化的超分子组装的2-尿素-4[lH]-上吡啶酮（UPy）修饰凝胶化水凝胶膜由动态和响应的协调和复杂金属离子及其配体。这种水凝胶薄膜可以卷成圆柱形塞子。所得水凝胶具有稳定的机械prop特性、自愈能力、高活性氧捕获能力和KGN和miR-26a的可控释放能力。在体外，KGN@PDA和miRNA@CaP通过JNK/RUNX1和RUNX1促进间充质干细胞的软骨和成骨分化。在体内，骨软骨塞表现出最佳的软骨下骨和软骨再生。通过在特定区域显著增加糖胺聚糖和胶原蛋白积累，以及成功的整合证明软骨下骨的新软骨。

图1定向GTU-Fe/KGN@PDA/miRNA@CaP

水凝胶修复骨软骨缺损的设计示意图

首先，纳米颗粒作为载体可掺入药物的表面或基质中，保护药物不受酶降解，提高其对软骨基质的渗透性，调节药物的药代动力学，有利于平衡治疗性化合物的疗效和毒性。在这项工作中，作者采用原位沉积位置策略来实现药物NPs和基因miRNA@CaPNPs在水凝胶膜上的空间分布。首先，通过Fe3+增强固化，制备了一种超分子组装的2-脲基-4[lH]-嘧啶酮（UPy）修饰凝胶化（GTU）水解凝胶膜。KGN是一种非蛋白质的软骨形成小分子，被聚多巴胺（PDA）包裹形成KGN@PDANPs，并锚定在软骨层中促进软骨修复。在各种研究中，KGN与组织修复和再生的有效结果有关，包括软骨再生、软骨保护、肌腱-骨愈合、伤口愈合和肢体发育。同时，miRNA-26amiR-26a是间充质干细胞（MSCs）成骨分化的启动子，与磷酸钙（CaP）共沉积生成miRNA@CaPNPs，将其固定在骨层中以促进骨再生。miR-26a在其他生物学功能中发挥着至关重要的作用，如调节糖尿病相关的骨代谢，降低炎症反应和促进血管生成。儿茶酚基与铁离子的络合作用使得KGN@PDANPs能够动态锚定在GTU-Fe水凝胶表面，而钙离子与明胶羧基之间的配位使得miRNA@CaP能够固定在GTU-Fe水凝胶上。随后，将生成的水凝胶膜卷成圆柱形塞，以模拟天然骨的哈弗氏管结构。这种直接仿生水凝胶支架能够控制上层的KGN原位释放用于软骨修复，底层的miR-26a原位释放用于软骨下再生。这种新颖的设计结合了双靶向生物活性因子和纵向定向结构来模拟骨软骨组织，具有很大的临床潜力有效的软骨和软骨下骨再生。

图2 KGN@PDA和miRNA@CaPNPs的制备与表征

KGN@PDA的合成分为两个阶段。首先，通过表征沉淀法制备KGN岩芯。将KGN/DMSO溶液逐渐加入到去离子水中，同时大力搅拌。由于溶剂性质的突变，KGN分子可以通过疏水效应聚集并沉淀形成KGNNPs。随后，将PDA外壳涂覆在KGNNPs上。KGNNPs的平均尺寸约为95.4nm，而KGN@PDANPs的平均尺寸约为288.4nm，这表明多个KGN颗粒可能形成单个KGN@PDA颗粒。KGN的电位为-22.0mV,KGN@PDA的电位为-63.3mV。HRTEM图像清楚地显示KGN@PDANPs具有直径约200-300nm的球形形貌。通过扫描电镜观察，在KGN@PDA表面可以看到不规则的不规则片状结构，这些结构由包覆了PDA的球形KGN组成。KGN@PDA中的C、O、N元素分布均匀。研究发现，PDA上的儿茶酚基团可以进一步与铁离子络合。因此，KGN@PDA可以与GTU-Fe水凝胶络合，用于在水下定量研究中原位沉积在水凝胶上。miRNA@CaPNPs具有不规则的球形。在元素图中，mir-26a衍生的氮主要分布在miRNA@CaPcom丛的中心，而钙和磷则位于NPs的外围。同时，钙离子与GTU-Fehydro凝胶的羟基和羧基之间的相互作用使miRNA@CaP能够原位沉积在水凝胶图案上，从而在随后的步骤中形成矿化的水凝胶。

图3 GTU-Fe/KGN@PDA/miRNA@CaP表征

作者合成了UPy-NCO、GTU和超分子GTU-fe水凝胶，并通过1H-NMR、UV-vis和FTIR对其化学结构进行了证实。所得的GTU水凝胶与传统的明胶支架相比，具有更大的孔隙特性。物理双网络GTU-Fe水凝胶具有粘弹性强、自愈快、近红外等特点，合成了NIR刺激反应作为装载药物/基因NPs的基质。明胶与UPy-NCO的投料比可以有效控制接枝率，选择6.12%的接枝率作为进一步研究的选择。得到的GTU-Fe水凝胶由于具有稳定的物理双网络交联，能够耐打结和拉伸。由于UPy分子之间的四重氢键的叠加作用以及铁与羧基的络合作用，GTU-Fe水凝胶的G′和G”明显高于其他水凝胶。在0.1~300%应变范围和0.1~10hz剪切速率范围内，G′和G”值保持稳定，说明GTU铁水凝胶具有机械稳定性。有趣的是，GTU-Fe水凝胶表现出自愈特性。GTU-Fe水凝胶，由于其设计独特，配置美观，操作方便，可模制成各种图案，然后卷成圆柱形的水凝胶支架。该支架在去除外部压缩力后可以立即恢复到原来的形状。抗压强度为2.59MPa，采用微型ct扫描检查所得水力凝胶的沟槽结构。水凝胶膜中的凹槽作为储层，分别容纳KGN@PDA和miRNA@CaP。将图案化的GTU-Fe水凝胶膜滚入近红外成像的骨软骨塞irra中3分钟，有效形成圆柱形支架。EDS光谱证实水凝胶图案由沟槽结构组成，GTU-Fe水凝胶表面覆盖着均匀大小的NPs。能谱分析证实KGN@PDA和miRNA@CaP在水凝胶上原位沉积，XPS规格tra的完整调查扫描如图3F所示。钙(Ca2p)和磷(P2p)的新峰出现在四个强烈的峰(O1s,N1s,C1s)旁边和Fe2p)，表明miRNA@CaP成功整合到表面。由于与酚羟基的络合，铁(Fe)的结合能增加，在GTU-Fe样品中，C-OH的结合能为531.10eV，加载KGN@PDA后增加到531.73eV。这一转变表明，由于Fe3+与C-OH的相互作用，C-OH周围电子云的den密度降低了。GTU-Fe/miRNA@CaP中C=O的结合能从532.18eV增加到532.40eV。羰基上氧(O)的孤对电子与Ca2+相互作用，导致C-OH周围的电子云密度降低。这些观察结果表明，羰基与Ca2+在GTU-Fe水凝胶中形成配位化合物起到了的协调作用。XPS数据证实KGN@PDA和miRNA@CaP在空间上原位沉积在图案水凝胶上。

图4体外评估KGN@PDA和miRNA@CaPNPs分别对MSCs的软骨形成和成骨以及MSCs中miR-26a的细胞摄取的影响

KGN@PDA和miRNA@CaP对使用共培养系统评估MSCs的成软骨和成骨分化软骨ECM分泌显著增强，MSCs中ColII、Sox9和aggrecan蛋白表达上调，同时观察到p-JNK和p-RUNX1蛋白上调，提示KGN通过JNK/RUNX1途径促进成软骨分化。相反，miRNA@CaP诱导了MSCs的显著骨基因分化，随着miR-26a浓度的升高(25-50nM)，钙结节、COL1A1蛋白、ALP和RUNX2蛋白的表达增加。GSK-3β蛋白表达的下调和p-β连环蛋白的上调表明miR-26a通过GSK-3β/β-catenin通路促进成骨分化。为了检测在单层培养中miR-26a的细胞摄取，选择Cy5作为荧光染料。与MSCs共培养miRNA-Cy5@CaP1天后，荧光显微镜图像显示细胞质内有高强度荧光信号。为了进一步研究miRNA@CaP是细胞内还是细胞外，进行了三维重建和断层图像。观察到细胞核被miR-26a包围，miR-26a主要分布在细胞膜内侧。这一结果表明miR-26a可以在早期有效转染到MSCs中，并在细胞质内均匀分布。

图5基于rna-seq的MSCs体外

软骨或成骨的转录组分析

通过RNA微阵列分析探讨KGN或miR-26a处理的间充质干细胞的基因表达谱。选择的差异表达基因(DEGs)进行聚类分析。KGN处理后，COL2A1、SOX9、ACAN上调，MMP23和ADAMTS5下调，表明软骨细胞基因分化上调，ECM降解减少。同时，COL1A1、ALP和RUNX2的上调提示mir-26a诱导了成骨分化。GO分析表明胶原含有ECM，发育细胞生长阴性，凋亡信号通路的调控参与软骨形成。相反，ECM组织、骨化和血管生成调控与成骨有关。KEGG通路富集分析显示，在kgn诱导的chon成骨和mir-26a诱导的成骨组中，PI3K-Akt、MAPK和内吞作用通路均显著富集。KEGG通路的基因集富集分析(GSEA)鉴定出19条参与软骨形成的通路和16条参与软骨形成的通路成骨作用。通路包括PI3K-Akt信号通路、ecm受体相互作用、局灶黏附和肌动蛋白细胞骨架通路的调节都显著富集。

图6 体内修复效果的宏观评价

体内实验表明，关节术后6周，各组均有缺陷保持与周围组织的区别。组I显示未填充的缺陷，而组II和组III为部分填充物。在IV组和V组中，缺陷边际模糊不清。然而，12周时，V组缺陷被有光泽的，光滑的白色组织。第一组的缺陷尺寸减小。在其余组中，缺陷也被光滑的白色纤维填充，但再生组织与周围软骨之间的边界很明显，特别是在II组和III组。修复后关节软骨的宏观数据及分级。V组在术后6周和12周宏观评分最高(n=6,p<0.05)。显微ct图像用于跟踪新软骨下骨的形成。在6周时，IV组和V组形成了更多的钙化组织，钙化组织的体积超过了III组、II组和I组。I组软骨下BV最小。在12周时，V组表现出最明显的次chon骨形成，几乎是新形成的骨填充整个软骨下区域。的修复效果IV组也有所改善，尽管低于v组。II组和III组也显示了丰富的软骨下骨形成，尽管明显少于IV组和v组。然而，在I组中，很少检测到软骨下骨。V组的BV在所有组中最高，说明miR-26a具有良好的成骨能力。6周时，组织学观察显示I组缺损软骨再生可忽略。II组缺损部分被软骨组织填充，但软骨基质缺乏。III组缺损含有丰富的软骨基质。IV组软骨下骨再生明显，骨分布稀疏软骨矩阵。V组表现出较好的丘下软骨再生和软骨再生。马松三色和红素-o染色显示软骨基质中有少量胶原蛋白和GAG，表明软骨基质正在生成。未观察到残留的水凝胶，表明水凝胶几乎完全降解。IV组软骨下骨形成改善，V组再生了丰富的软骨基质，尽管新软骨不连续性。vdem组软骨再生效果最好，缺损主要以白色新生软骨填充。这种连续的新软骨与正常软骨相似，软骨基质丰富，胶原排列与正常软骨一致。观察到完整的软骨下骨重建。V组患者术后6周和12周ICRS评分最高(p<0.05)。

图7体内修复效果评价

偏光显微镜显示，从6到12周，所有组的lagenous纤维水平都有所增加。然而，在12周时，I组修复组织内的胶原纤维被破坏组织。ⅱ组和ⅳ组胶原纤维更加规整。III组纤维丰富，而V组胶原纤维丰富且几乎垂直，类似于天然软骨。修复软骨的胶原蛋白含量的指标略弱于周围软骨。IV组和V组修复区软骨下骨及邻近组织双折射相似。胶原蛋白在修复部位的分布。12周时，第一组表面与基底区胶原蛋白分布无明显差异，提示仅形成纤维状胶原蛋白。在II组中，表面区胶原纤维主要取向在20°-20°之间，占所有纤维的34.6%，而在i组中这一比例为26.4%。在基区中，胶原纤维取向更偏向于±60°-±90°，II组的比例高达45.4%空白组为42.6%。这些结果在III组进一步改善，并在V组达到顶峰，表面区平行胶原含量分别为44.1%和53.0%，基底区平行胶原含量分别为66.8%和68.3%。在III组和V组中观察到丰富的ColII染色，ColII含量从6周到12周增加。在对照组中，ColII主要局限于宿主软骨和缺损基的边界。第二组及ⅳ组的ColII染色较ⅰ组更强烈，尤其在界面处。V组新软骨与软骨下骨无骨融合。全阳性ColII阳性分析显示，V组ColII含量明显高于其他组。

文章亮点：

1、构建多因子定向支架刺激骨软骨再生。

2、首次证明药物和基因纳米颗粒通过金属配体在空间上沉积在薄膜上交互。

3、首次采用薄膜滚动入路构建骨软骨塞，模拟哈弗氏管结构自然骨。

——THE END——

来源丨 Nano-micro Letters, 纳米载药平台