联合型学习是将不同时间发生的事件刺激联系起来，进而指导产生适应性行为反应的一种能力。这种联合型学习(associative learning)能力是人和动物生存所必需的脑高级功能。在精神分裂症、自闭症等疾病状态下，该学习功能会发生早期损害。因此，对联合型学习行为的细胞和分子机制研究，将为上述疾病的早期诊断和治疗效果判断提供重要帮助。

经典眨眼条件反射是研究联合型学习的一种常用行为模型。该反射训练需要将条件刺激(conditioned stimulus，CS，如闪光)和非条件刺激(unconditioned stimulus，US，如角膜吹气)反复强化配对，使动物学会一个针对CS的条件性眨眼反应(conditioned eye blink response，CR)，以躲避US产生的角膜伤害。根据CS和US的出现是否存在时间上的间隔，该反射可被进一步区分为延迟性眨眼条件反射(delay eye blink conditioning，dEBC即CS和US之间有时间重叠)和痕迹性眨眼条件反射(trace eye blink conditioning，tEBC即CS和US之间存在时间间隔)两种模式。

手术流程

用异氟烷诱导麻醉小鼠。诱导麻醉完成后，将动物固定于脑立体定位仪上。去除动物颅顶部皮肤上的毛发，并进行常规消毒。用眼科剪沿颅骨中线依次剪开皮肤以及皮下组织，暴露小脑至大脑前囟上方颅骨。用弹簧剪、尖镊分离颅骨表面软组织。将10%双氧水擦拭颅骨表面，充分显露颅骨骨性标志。利用脑立体定位仪测量前后囟高度，确保颅骨水平。在右侧小脑上方以及右侧大脑皮层上方，使用颅钻开2个直径为0．5mm的圆形小孔，植入2颗已消毒的不锈钢螺钉，并焊接地线与参考线。从小鼠左侧上眼睑轮匝肌的中后部，等距离穿刺2根不锈钢钢丝)作为肌电信号记录电极。配取水泥将不锈钢螺钉和肌电电极固定于颅骨表面，并将4张三角形铜网粘附于水泥上方。使用颅钻在左侧小脑上方(坐标:前囟后6.3mm，左侧旁开1.7mm)打磨出边长为1mm的方形骨窗，挑开硬脑膜。利用脑立体定位臂，植入多通道记录电极至小脑皮层，初始深度为1.5mm。使用牙科水泥固定电极底座，将低黏度硅胶覆于盖骨窗。收拢铜网，并将用于给予CS的LED光源以及通气管接口固定于铜网上。最后，用牙科水泥加固铜网底部。在手术过程中，全程使用恒温加热垫维持体温。术后小鼠需要5～7d的恢复。在此期间，通过微推进器将记录电极尖端以70μm/d的速度缓慢向目标区域推进，直到可以稳定地记录到小脑皮层神经元的放电活动。

行为训练

经典TEBC训练周期包括适应期1d、训练期10d（连续）和消退期1d，行为训练全程均在隔音、避光的屏蔽柜里进行。训练周期包括2d适应期和5d的tEBC训练。在适应期间，将小鼠置于声光屏蔽的行为训练箱内(45cm×25cm×20cm)。其头顶部连接16通道前置放大器和肌电记录线，铜网上连接LED光源和气管导管。受试小鼠在暗环境下自由探索训练环境，适应时长约为40min/d，期间不给予任何刺激。

tEBC训练在适应期结束后开始。tEBC习得训练期间，将受试小鼠置于适应期间相同训练环境下。条件刺激是1个持续150ms的蓝光脉冲，非条件刺激是一个压强0．6psi，持续100ms的气流。将一气管导管固定于受试动物左侧眼角膜前0.5～1.0cm，用来释放US。从CS结束到US开始的刺激间期时长为250ms。小鼠每天接受100次CS和US的配对训练，每次配对训练的时间间隔为18～23s。

训练期为CS-US配对训练，CS是一个3kHz、250ms、85dB的纯音，CS出现同时触发“SBO-1眨眼条件反射和识别学习行为自动训练系统”，于CS开始后500ms给予小鼠左侧眼角膜一个压强为3Psi、持续时间为100ms的束状干燥氧气流（US），每次CS-US配对训练的间隔时间为（30±5）s，每个训练期共计100次配对训练，具体模式如图1所示。同步记录动物的PFC-ERP情况，利用RM6280C型八道生理信号采集处理仪进行数据采集。在适应期和消退期不给予US，仅仅只有CS出现。小鼠在整个行为训练过程中身体均被置于直径3cm、长12cm的塑料圆柱形固定筒内，其头颈部露在筒外。用脑立体定位仪前端嘴固定器夹住小鼠嘴鼻部，并将脑立体定位仪两根侧梁上的耳杆顶住小鼠头颅固定支架，以减少小鼠身体晃动从而引起的实验数据的偏差。

在连续5d CS和US配对刺激训练过程中，小鼠的CR逐渐出现，CR发生率幅度逐渐增加。根据CR发生率的水平，将训练第1、2天定义为条件反射建立早期阶段，将训练的第4、5天定义为条件反射建立后期阶段。

Figure 1小鼠痕迹性眨眼条件反射的建立

A:痕迹性眨眼条件反射行为训练模式图(左)和训练1～5d小鼠上眼睑肌电活动强度变化代表图(右);B:条件眨眼反应发生率随训练时间的变化

眨眼活动测量

眨眼活动的记录采用高灵敏度的肌肉张力换能器进行测量，换能器一端连接尼龙细线，尼龙细线另一端拴上蛙心夹，将此蛙心夹夹住小鼠左侧上眼睑使其刚好紧绷。左侧上眼睑的活动情况通过换能器所测到的张力变化转换为电位波动予以反映。记录数据的八道电生理生物信号记录仪参数设置为：16～3kHz（CS及US信号），带通：DC～100Hz（张力信号，传感器信号）；500mV（CS及US信号），灵敏度5mV（张力信号），采样频率10kHz。

文献引用

1.Evolving Models of Pavlovian Conditioning: Cerebellar Cortical Dynamics in Awake Behaving Mice[J]. Michiel M. ten Brinke;;Henk-Jan Boele;;Jochen K. Spanke;;Jan-Willem Potters;;Katja Kornysheva;;Peer Wulff;;Anna C.H.G. IJpelaar;;Sebastiaan K.E. Koekkoek;;Chris I. De Zeeuw.Cell Reports,2015(9)

2.Relating Cerebellar Purkinje Cell Activity to the Timing and Amplitude of Conditioned Eyelid Responses[J]. Hunter E. Halverson;;Andrei Khilkevich;;Michael D. Mauk.Journal of Neuroscience,2015(20)

3.Reevaluating the ability of cerebellum in associative motor learning. LI D B;YAO J;SUN L,et al.Sci Rep.2019

4.Stimulating thought:a functional MRI study of transcranial direct current stimulation in schizophrenia. Orlov ND;O''Daly O;Tracy DK,et al.Brain.2017

5.章利彬,陈浩,张洁,等.小鼠痕迹性眨眼条件反射建立过程中小脑皮层神经元活动的变化特征[J].第三军医大学学报,2020,42(12):1188-1194.

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