流行病学背景介绍

呼吸道感染是临床最常见的感染性疾病之一，也是造成全球死亡人数最多的一类感染。感染种类多样，由多种微生物包括细菌、病毒、支原体、真菌等引起，往往还存在复杂的混合感染。精准鉴别病毒性、细菌性及真菌性感染，有效区分单一病原体及混合感染，对于感染性疾病的治疗及预后有着十分重要的意义。

呼吸道感染的鉴别诊断方法有很多种，其中传统的微生物培养和涂片依然是细菌和真菌诊断的“金标准”。近10年来，基于多重PCR（polymerase chain reaction，PCR）技术的多重病原检测技术得到了较快发展，单次反应可以检测10~30种病原。自2008年基于新一代测序技术（next generation sequencing，NGS）的临床宏基因组学（metagenomics NGS，mNGS）技术得到了迅速发展和临床推广，在少见/罕见病原及新发突发呼吸道传染病病原鉴定方面取得了优势。

随着NGS的快速发展，其在感染病原体鉴别诊断中的应用越发广泛，其中mNGS可一次性检测出样本中所有致病微生物，在病原检出率上具有优势。而靶向高通量测序（targeted next generation sequencing，tNGS）技术，对于疑难、危重及混合病原体感染的快速诊断具有很高的应用价值。尽管NGS技术在呼吸道感染病原检测方面已经取得了很大进展，但NGS方法检测流程复杂，步骤涉及样本核酸提取、文库构建、生物信息学分析等多个流程，尤其是文库构建流程，步骤繁琐，随着样本量的增多，人工操作过程中容易出现失误，所以实验流程自动化标准化是确保最终结果可靠性的趋势选择。

产品介绍

青元开物致力于精准检测样本前处理自动化解决方案的研发，其推出的“全自动基因测序文库构建系统”是一款专门为测序文库构建的全自动化工作站，集成文库构建、浓度质控及均一化三位一体，可实现建库流程的高度自动化。

本仪器配置高精密移液系统，可以实现不同体积及反应体系配制；设有可升降磁力架，可以完成磁珠纯化和片段筛选；并集成 PCR 扩增模块和浓度质控模块，可以实现建库流程的高度自动化；拥有充足的台面板位，可同时满足文库构建以及靶向捕获的过程；另外还配置了全面的防污染系统，有效降低污染风险。软件界面为图示化人机交互界面，用户按需编辑流程，具有高度自动化的特点。

案例分享

青元开物基于此工作站开展了新冠检测病毒的全基因组建库工作，具体流程如下：

1. 实验方法

1）样本要求

鼻拭子、咽拭子、唾液、尿液、皮损组织、渗出液、血液等临床样本经核酸提取后可用于全基因组建库

2）文库构建

3）测序

富集纯化后的文库，通过质控、均一化及pooling后可上机illumina测序。

4）数据分析

测序数据经过数据质控后，进行结果分析。

2. 实验结果

扩增子文库构建流程可以通过EoSBot®Seq24全自动基因测序文库工作站实现全自动化，工作站配置三个移液器，一个8通道（20微升）、一个8通道（200微升）和一个24通道（500微升），工作站集成温控、纯化、扩增、荧光定量等功能模块，台面布局如下图所示，全自动实验流程全程预计6h，整个实验流程几乎可实现无人值守，有效减少人工操作时间。

台面布局

自动化及人工操作文库构建结果展示

新冠病毒人工及自动化建库结果对比，文库浓度一致性较好

手动pooling和自动化pooling在整体测得数据量的均一性上差异较小

3. 总结讨论

在这个案例中，我们展示了一个自动化、超高效和流线型的扩增子文库准备和规范化工作流程。通过将建库流程自动化，流程的人工操作时间大大减少，同时提供具有高产量的平衡库，生成高质量的测序数据。