条件性恐惧(conditioned fear，CF)和单一的长期压力被广泛用于建立PTSD的动物模型研究。为了最大限度模拟PTSD患者的病理生理学改变，本研究采用CF联合单一连续应激(single prolonged stress，SPS)的双重应激(CF+SPS)建立小鼠PTSD模型，诱导小鼠情绪障碍和过度恐惧反应。

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PTSD模型的建立

在制备模型前，连续1周每日抚摸小鼠2次以减少应激反应。采用CF+SPS双重应激方法建立小鼠PTSD模型。实验前1d，将小鼠放置在行为学室适应环境。恐惧记忆箱放置在配备有照明灯、小风扇、声音发生器以及与声音发生器相联的扩音器和摄像头的隔音箱中，风扇用于通风和产生背景噪音，这对于以声音作为条件刺激尤其重要。小鼠所有运动轨迹由视频跟踪和自动分析系统记录。CF实验开始，将小鼠放进恐惧记忆箱(30cm×30cm×60cm)中自由探索180s，然后给予蜂鸣(15s，1kHz，75dB)，蜂鸣的最后5s同时给予足部电击(电流强度2mA)。间隔60s后再开始第二轮蜂鸣和电击。小鼠在被电击时发生惊叫、惊跳、逃避等，听到声音提示时出现慌张、逃避或者僵立行为(除呼吸外无其他运动行为)。重复5个循环，持续5d，每日在同一个时间段进行上述操作。第6日进行单一连续应激实验:先将小鼠束缚固定2h(8∶00～10∶00)，接着立即将小鼠放入装满20～24℃水的玻璃圆柱形水箱(直径24cm，高度50cm)强迫游泳20min，待小鼠恢复15min后，用乙醚麻醉至意识模糊(夹脚趾和夹尾巴没有反应)，每只小鼠麻醉2次，结束后将小鼠放回笼中。

旷场实验

旷场实验是检测动物焦虑水平的经典行为学方法，用来评价动物的警觉反应、焦虑状态和环境适应能力。参照前期研究，实验装置为单独配有弱光和换气系统的隔音箱，内装有玻璃树脂做成的30cm×30cm×30cm的盒子。盒子底面被分割为16个等大的方格。实验第13日，灌胃给药后2h开始实验，将小鼠头朝开场箱的某个固定角落放入，自由活动15min，应用JLCY-3小鼠自发活动视频跟踪分析系统记录实验小鼠15min内的自发活动。记录各组小鼠之间的中央区域运动时间、中央区域运动路程与运动总路程，中央区域是盒子底面积中心9个方格区域。中央区域运动时间百分比=中央区域运动时间/自由活动总时间，中央区域运动路程百分比=中央区域运动路程/总活动路程。表现焦虑样行为的小鼠喜欢靠近墙壁并更多地在四周活动，焦虑程度较低的小鼠在盒子的中央开放区域会活动更多的时间。每只小鼠完成实验后均用乙醇棉球擦拭敞箱，以除去前一只小鼠余留的气味，避免影响下次测试结果。

高架十字迷宫实验

旷场实验结束后4h，进行高架十字迷宫实验，用来检测动物焦虑和恐惧水平。装置包括两个25cm×8cm×0.5cm相对开臂和两个25cm×8cm×12cm相对闭臂，距离地面50cm高，迷宫中央交叉区域8cm×8cm，上方安装录像监控器，以录制动物在迷宫中的活动情况。实验开始，将小鼠头朝开臂放入迷宫中央区，摄像监控记录5min内实验小鼠进入开臂和闭臂的次数和时间。开臂进入次数百分比=开臂进入次数/(开臂进入次数+闭臂进入次数)，开臂进入时间百分比=开臂进入时间/(开臂进入时间+闭臂进入时间)。记录结束后将小鼠放回饲养笼，用乙醇擦拭迷宫，消除气味对后继实验小鼠的影响。

悬尾实验

悬尾实验利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有不动状态来评价小鼠的抑郁行为。实验第14日，将实验小鼠尾部远端1.5cm处固定悬挂于40cm×40cm的白色树脂玻璃盒内，小鼠头部距地面15cm。摄像记录6min，统计后5min小鼠不动时间总和。

僵住时间测定

实验第15日进行情境和线索CF测试。在情境条件性恐惧测试中，将小鼠置于相同的恐惧记忆箱(30cm×30cm×60cm)中不给予蜂鸣和电击自发活动5min，记录小鼠的僵住时间。僵住行为是小鼠表达恐惧的方式，行为学表现为除呼吸运动外全身其余的肌肉运动均消失。小鼠的僵住时间百分比=僵住时间/总时间。每只小鼠实验间隔需用乙醇擦拭箱体以消除气味的影响。4h后进行线索CF测试。首先改变测试箱体，将导电格栅地板替换为网格薄板，黑白格图案贴到测试箱的内壁上，用10mL/L的醋酸溶液来遮掩之前的清洁溶液，为线索CF测试提供新环境。让小鼠在这样一个新的测试箱内自发活动3min，然后连续3次循环蜂鸣刺激(在每分钟的前15s蜂鸣，180s，2kHz，75dB)，没有电击刺激。记录3min内小鼠的僵住时间，计算小鼠的僵住时间百分比，以反映小鼠的恐惧行为。

Fig1 情景和线索CF实验评估小鼠恐惧样行为

文献引用：

1.创伤后应激障碍临床诊断与心理干预的研究进展[J]. 黄瑞雯;吴诗瑜.中国临床医学,2021(02)

2.Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging[J]. Lingling Zhang;Kuan Hu;Tuo Shao;Lu Hou;Shaojuan Zhang;Weijian Ye;Lee Josephson;Jeffrey H.Meyer;Ming-Rong Zhang;Neil Vasdev;Jinghao Wang;Hao Xu;Lu Wang;Steven H.Liang.Acta Pharmaceutica Sinica B,2021(02)

3.A Review on Post-traumatic Stress Disorder (PTSD): Symptoms, Therapies and Recent Case Studies[J]. Amandeep Thakur;Amit Chaudhary;Bhupinder Kumar;Diksha Choudhary.Current Molecular Pharmacology,2022

4.A Review of PTSD and Current Treatment Strategies.[J]. Schrader Christian;Ross Abigail.Missouri medicine,2021

5.李旭波,靳雨晨,王欣赏,等.ZBD-2改善创伤后应激障碍模型小鼠恐惧焦虑和抑郁样行为的作用[J].空军军医大学学报,2023,44(12):1170-1176.

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