• ‍‍慢性束缚应激模型（Chronicrestraintstress,CRS）‍

造模步骤如下：

1）用电钻在50mL离心管上打孔，确保小鼠在束缚期间能正常呼吸。

2）为避免前期造模时小鼠产生应激反应，造模前用异氟烷气体将其麻醉，随后放入打好孔的离心管中，拧紧后盖，确保小鼠无法逃离。将其放回原鼠笼内每天束缚6h后恢复食水，清洗离心管内小鼠排泄物，晾干后待第二天使用。

3）连续造模35d后进行小鼠焦虑、抑郁样及痛行为检测。

假手术组小鼠，与CRS组小鼠相比，在相同时间内去除小鼠食水，但小鼠可在鼠笼中自由活动，6h后恢复食水，连续35d后进行行为学检测。

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  • 旷场实验（Openfieldtest,OFT）

旷场实验测试前1w实验者可每天亲抚小鼠几分钟以减轻应激反应。实验前1h将小鼠放于待测行为室适应，适应前调节好光照强度、旷场录像设备，清洁旷场底部。旷场装置为50cm×50cm×40cm无盖箱体，实验开始时将小鼠轻轻放入箱内底面中央区，拉好周围帘子，同时进行摄像和计时（10min），保持测试一直处于安静环境。在两次测试之间，用75%酒精彻底清洁箱体内壁和底部，以去除上只小鼠残留气味，待酒精完全挥发后，测试下一只小鼠。旷场测试完毕后，使用VisuTrack动物行为分析软件进行视频分析，主要测量参数为小鼠在旷场中央区活动的距离和时间及活动总距离。

  • 高架十字迷宫实验（Elevatedplus-maze,EPM）

高架十字迷宫实验测试前1w实验者可每天亲抚小鼠几分钟以减轻应激反应。实验前1h将小鼠放于待测行为室适应，适应前调节好光照强度、高架录像设备，清洁高架十字臂。高架装置是由一个中央区（5cm×5cm）和两个相互垂直的开臂（30cm×5cm×20cm）和两个闭臂（30cm×5cm×20cm）组成的迷宫。实验开始时将小鼠轻轻放置在中央区，确保小鼠头部朝向开臂，拉好周围帘子，同时进行摄像和计时（5min），保持测试一直处于安静环境。在两次测试之间，用75%酒精彻底清洁高架十字臂，以去除上只小鼠残留气味，待酒精完全挥发后，测试下一只小鼠。高架测试完毕后，使用VisuTrack动物行为分析软件进行视频分析，主要测量参数为小鼠在开臂活动的距离和时间及活动总距离。

  • 悬尾实验（Tailsuspensiontest,TST）

悬尾实验测试前1w实验者可每天亲抚小鼠几分钟以减轻应激反应。实验前1h将小鼠放于待测行为室适应，适应前调节好光照强度、悬尾实验装置及录像设备。悬尾装置为高于测试平台60cm的带有顶部横梁的支架，实验开始时将胶带一端固定在顶部横梁，另一端固定小鼠尾巴末端使其悬挂，头部距装置底部约20cm，录制视频6min，保持测试一直处于安静环境。在两次测试之间，用75%酒精清洁装置底部，以去除上只小鼠残留气味，待酒精完全挥发后，测试下一只小鼠。悬尾视频录制完毕后由一位观察者用同一标准计算小鼠不动时间。

  • 糖水偏好实验（Sucrosepreferencetest,SPT）

糖水偏好实验开始前将小鼠进行单笼饲养使其适应单独环境：第一天，每个笼子配备两瓶1%蔗糖溶液与鼠粮；24h后，将其任意一瓶蔗糖溶液换成正常饮用水，12h后调换两瓶位置，12h后移除小鼠所有食水；24h后，放置一瓶蔗糖溶液和一瓶饮用水，放之前进行称量并记录总质量；12h后，对所有瓶子再次进行称量，在此期间需轻拿轻放水瓶，避免液体洒漏。蔗糖溶液与饮用水消耗量通过称量瓶子前后质量差所得。蔗糖偏好计算公式如下：糖水消耗量/糖水消耗量+水消耗量。

为探究LHPV­LHb神经环路在生理、病理状态下的作用，采用光遗传技术实现特异性激活或抑制该神经环路，来检测小鼠在感觉异常与情绪障碍中的作用。

在病毒注射3w后，进行双侧光纤埋置。将上次注射完光遗传病毒的PV-Cre小鼠用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉（10mg/kg），等小鼠进入深麻醉状态后，将其头部固定在小鼠适配器上，操作过程中保证左右耳杆对称，将眼睛用红霉素软膏遮住，防止无影灯照伤小鼠眼球。

光遗传结合行为学检测

光遗传调控参数，蓝光激光器（波长为460nm），蓝光刺激频率为40Hz，脉宽为2ms，光纤末端光照强度为5mW；黄光激光器（波长为589nm），光照强度为5mW的直流光。

以下为OFT、EPM、TST检测必需步骤：

1）实验测试前1w实验者可每天亲抚小鼠几分钟以减轻应激反应。实验前1h将小鼠放于待测行为室适应，适应前连接好激光器、光纤滑环和光纤跳线；调节好光照参数、房屋光照强度、录像设备等。

2）行为视频正式录制开始前将小鼠用异氟烷气体麻醉，将光纤跳线与其头部陶瓷光纤连接，放回原鼠笼待其恢复并适应5min左右开始正式试验。

3）小鼠在整个实验阶段剩余实验步骤同第二部分实验。

光遗传结合行为学方法对动物机械痛和热痛阈值的检测

为深入探究LHPV­LHb神经环路对慢性痛的调控作用，分别在行为学检测过程中结合光遗传技术。首先实验人员对SNI组、CRS组及Sham组小鼠进行机械及热痛刺激阈值检测，确认小鼠产生痛觉敏化，随后激活（蓝光）或抑制（黄光）LHPV­LHb神经环路进一步检测小鼠的机械和热痛阈值。光遗传所需参数同上述实验，在操作过程中激光的连续刺激不得超过10min，在给光的时间范围内依次检测完机械痛与热痛阈值所需次数。

光纤钙成像实验

采用在体光纤钙成像的方法检测在不同生理状态下LHb脑区谷氨酸能神经元的钙活动情况。将Vglut2­Cre小鼠随机分为Sham、SNI和CRS三组，采用脑立体定位注射方法在其LHb脑区注射rAAV2/9­EF1α­DIO­Gcamp6s病毒，术后2w在同一位点埋置光纤，待小鼠恢复1w后进行钙信号记录实验。

钙信号记录

记录三组小鼠在悬尾实验、高架十字迷宫实验、不同机械刺激与热辐射刺激时LHb脑区谷氨酸能神经元的钙信号变化。试验开始前准备好所需行为测试仪器，将小鼠用异氟烷诱导麻醉，将连接好信号采集器的光纤跳线另一端连接在小鼠头部陶瓷插芯上，做好避光措施防止外界光线干扰。待小鼠恢复至清醒状态后开始钙信号记录与行为视频录制，同时做好实验记录用于后续数据分析时校对。

采用在体光纤钙成像技术，在Vglut2­Cre小鼠LHb脑区进行单侧病毒注射和光纤埋置，同时随机分组造模。在SNI组小鼠造模7d后进行机械、热辐射刺激后足的同时记录LHb脑区钙信号活动，SNI28d时检测其在高架十字迷宫活动时的钙信号活动，SNI56d时进行悬尾实验钙信号记录。CRS组小鼠在造模35d后分别进行高架十字迷宫、悬尾实验、机械和热辐射刺激时LHb脑区钙信号的记录。钙信号采集结束后取材观察小鼠病毒注射部位及光纤埋置位置是否准确。

Fig1 SNI模型对LHb脑区谷氨酸能神经元钙活动的影响

A：悬尾实验中，小鼠挣扎瞬间钙信号荧光定量统计图和测定轨迹图；

B：高架十字迷宫实验中小鼠从闭臂到开臂瞬间钙信号荧光定量统计图和测定轨迹图；

C-I：痛行为实验中，小鼠同侧后足受到不同克度vonFrey（C-F）、Brush（G）、Pinch（H）、Heat（I）刺激时瞬间钙信号荧光定量统计图和测定轨迹图。

文献引用：

1.外侧缰核—中脑腹侧被盖区传导通路参与慢性痛诱导抑郁的机制研究[D]. 张春奎.中国人民解放军空军军医大学,2018

2.Chronic restraint stress causes anxiety- and depression-like behaviors, downregulates glucocorticoid receptor expression, and attenuates glutamate release induced by brain-derived neurotrophic factor in the prefrontal cortex[J]. Shuichi Chiba;;Tadahiro Numakawa;;Midori Ninomiya;;Misty C. Richards;;Chisato Wakabayashi;;Hiroshi Kunugi.Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry,2012

3.Mapping pain activation and connectivity of the human habenula.[J]. Shelton L;;Pendse G;;Maleki N;;Moulton E A;;Lebel A;;Becerra L;;Borsook D.Journal of neurophysiology,2012

4.The lateral hypothalamic parvalbumin-immunoreactive (PV1) nucleus in rodents.[J]. Mészár Zoltán;;Girard Franck;;Saper Clifford B;;Celio Marco R.The Journal of comparative neurology,2012

5.Synaptic potentiation onto habenula neurons in the learned helplessness model of depression.[J]. Li Bo;;Piriz Joaquin;;Mirrione Martine;;Chung ChiHye;;Proulx Christophe D;;Schulz Daniela;;Henn Fritz;;Malinow Roberto.Nature,2011

6.杨新江. 外侧下丘脑-外侧缰核神经环路调控慢性痛与抑郁共病机制研究[D].延安大学,2024.DOI:10.27438/d.cnki.gyadu.2023.000697.

7.Lateral hypothalamic circuits for sleep–wake control[J]. Takayuki Yamashita;;Akihiro Yamanaka.Current Opinion in Neurobiology,2017

8.A role for GABAergic interneuron diversity in circuit development and plasticity of the neonatal cerebral cortex[J]. Simon JB Butt;;Jacqueline A Stacey;;Yayoi Teramoto;;Cristiana Vagnoni.Current Opinion in Neurobiology,2017

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