冠状病毒（如SARS-CoV-2，SARS-CoV，MHV，MERS-CoV等）属于正链 RNA 病毒家族，在复制过程中会利用自身的非结构蛋白重构宿主细胞内膜，形成双层膜囊泡（Double membrane vesicle,DMV）结构，为病毒基因组 RNA的合成和修饰提供一个中心枢纽，保护病毒 RNA逃避宿主细胞免疫系统的监控。
尽管DMV在冠状病毒复制中的重要功能已得到证实，但新合成的病毒 RNA 分子如何转运以进行蛋白合成和病毒粒子组装的机制仍不清楚。利用原位低温电子断层扫描技术 （In situ cryo-electron tomography, cryo-ET） 进行的研究发现，在MHV和SARS-CoV-2感染细胞中的DMV上存在孔复合体。这种孔复合体的分子量约为 3 MDa，是具有 6 倍对称的双跨膜结构。冠状病毒三分之二以上 （约 20 kb） 的基因组RNA编码 16 个非结构蛋白 （non-structural protein, nsp） ，与宿主蛋白一起构成冠状病毒复制-转录复合体 （replication-transcription complex，RTC） 。其中，非结构蛋白nsp3和nsp4是形成DMV孔复合体所需的最小病毒成分。然而，利用原位方法解析的这些孔复合体的分辨率有限 （约 20 Å） ，DMV 孔复合体形成的分子机制以及整个孔复合体的结构细节仍未被揭示。
2024年8月14日，香港大学李嘉诚医学院倪涛课题组联合袁硕峰课题组在Nature在线发表了题为 “Molecular Architecture of Coronavirus Double Membrane Vesicle Pore Complex”的研究成果。该研究团队利用分离纯化的SARS-CoV-2 DMV，通过Cryo-ET技术和断层扫描平均法 （subtomogram averaging, STA） ，首次解析了4.2 Å分辨率的DMV孔复合体结构，初步揭示了病毒利用DMV孔复合物进行RNA转运的分子机制，为开发针对冠状病毒DMV 孔复合体形成和RNA 转运的抗病毒药物提供了重要的指导信息。
研究团队在体外利用HEK293F表达系统，经过一系列样品制备条件的摸索，成功表达并纯化分离得到包含非结构蛋白nsp3和nsp4的双层膜囊泡DMV。通过应用serialEM PACE-tomo脚本采集了大量的冷冻电子断层扫描数据，通过子断层平均方法，最终成功解析了DMV nsp3-4孔复合体的三维结构。该结构显示，除了nsp4的C端结构域呈现3倍对称性，完整的孔复合物呈6倍对称性并由12个nsp3和12个nsp4构成，体现出DMV孔复合体独特的化学计量比和拓扑结构 (图1) 。
图1 DMV nsp3-4孔复合体的三维结构
对DMV孔复合体的结构细节进行分析发现，nsp3和nsp4的跨膜域相互交错，在双膜连接处促发膜局部出现高曲率进而诱导孔的产生。nsp3 定位于DMV外膜（胞质侧），nsp4 则位于双层膜交界处和内膜。两种非结构蛋白nsp3和nsp4的跨膜区以及双层膜夹层内侧的ecto结构域构成整个孔复合体的结构基础。进一步的结构分析显示，一系列疏水和亲水的氨基酸残基构成nsp3和nsp4 ecto结构域的相互作用界面。例如，D1478、Y1483、L1486和Q1490的突变可以破坏nsp3与nsp4的相互作用进而影响DMV的形成 （图2） 。
图2 nsp3和nsp4的相互作用
更重要的是，研究发现，DMV孔复合体的中心具有含三个收缩位点的带正电荷通道，可以介导RNA 和代谢产物的跨膜运输。在孔道中对称分布的精氨酸残基在不同的β冠状病毒中高度保守，对于病毒的复制至关重要（图3）。这个孔道直径大约1.7纳米，足够介导单链RNA穿过。
图3 DMV孔复合体结构示意图
综上，这项工作利用分离的SARS-CoV-2 DMV为在近原子分辨率层面研究病毒复制机制提供了宝贵的体外系统，DMV孔复合体结构的解析为人们理解冠状病毒的复制提供了新的视角，也为剖析由 DMV 孔复合体和 RNA 复制/转录机器组成的完整复制/转录复合体的结构和功能奠定了重要基础。
香港大学李嘉诚医学院博士研究生黄亦馨为论文的第一作者。香港大学李嘉诚医学院倪涛教授和袁硕峰教授为该论文共同通讯作者。此外，香港大学李嘉诚医学院博士后王同云，硕士生钟理捷，博士后张文欣，博士研究生张煜以及香港理工大学于秀莲教授在其中做出了重要贡献。该研究得到了香港大学李嘉诚低温电子显微设施实验室的大力支持，尤其是郭静、刘闯、付鲁堂和EMBL的杨正宜老师等对于数据采集的支持。
倪涛课题组致力于应用综合结构生物学方法研究正链RNA病毒转录复制细胞器的功能及膜重塑过程，应用包括冷冻电镜单颗粒（cryo-EM SPA）、低温电子断层扫描 （cryo-ET）以及冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）技术等。课题组目前有多个方向的课题正在展开，长期诚招相关专业的博士后和博士生。详细招聘信息见：
https://www.tni-lab.org/
袁硕峰课题组长期致力于广谱抗病毒研究，主要专注病毒宿主相互作用及感染引起的宿主代谢紊乱等相关方向。详细招聘信息见：https://hkumicro.hku.hk/university-staff/dr-yuan-shuofeng/
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07817-y
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