结直肠癌（CRC）是最常见和最致命的癌症之一。CRC 具有异质性肿瘤微环境，具有独特的成纤维细胞群。肿瘤生长和进展的过程与肿瘤相关成纤维细胞（CAF）有关。据报道，CAF 调节炎症细胞的募集，并影响血管生成、肿瘤干性和耐药性。因此，CAF 在很大程度上促进了癌症的进展，被认为是治疗的重要靶点。
尽管在胰腺导管腺癌、乳腺癌和肺癌中对 CAF 的表征方面取得了进展，但仍缺乏对结直肠癌 CAF 的全面分析。研究已经报道了两种主要的 CAF 亚型，它们要么表达细胞外基质（ECM）分子和调节剂（称为CAF-A），要么表达肌成纤维细胞的标志物（称为CAF-B）。此外，CRC CAF 特征与预后不良相关。然而，由于以往的研究主要集中在分析 CRC 的整体细胞组成上，因此对 CAF 亚型的广泛分析受到测序 CAF 数量相对较少的阻碍。CAF 在 CRC 中起着核心作用，目前仍缺乏对 CAF 异质性的全面分析。
最近，在德国哥廷根大学医学中心的一项研究中，通过结合单细胞RNA测序（scRNA seq）和空间蛋白质组学，对人类结肠和 CRC 组织样本中的成纤维细胞异质性进行了深入分析，发现并命名了一种新的亚型 TinCAF，证明了 TinCAF 特征标志物的高表达与 CRC 患者的无复发生存期缩短有关。这种新发现的 CAF 可能代表了未来 CRC 免疫疗法的潜在靶点。研究成果发表在Cancer Letters期刊题为“Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling”。
首先，研究人员全面分析了成纤维细胞的异质性，通过对8个不同样本（6个CRC样本，2个正常结肠样本）进行 scRNA-seq（图1 A、B），发现成纤维细胞聚集成了11个不同的簇（图1 C）。有趣的是，大多数簇在正常样本和 CRC 组织中都被发现（图1 D），然而，簇3、5、7 和 9 几乎只存在于 CRC 组织中，因此代表了 CAF 特异性簇。
基于对差异表达标记基因的分析，已知的成纤维细胞亚型，如apCAF（簇1）、“上皮维持”成纤维细胞（簇2）、myCAF（簇3）和 iCAF（簇7）被鉴定出来（图1 E）。簇9 显示 MKI67、CENPF、CDK1 和其他细胞周期相关基因的高表达，表明该簇为增殖成纤维细胞的区室。簇5 不表达已知的 CAF 特征标记物，但显示出免疫相关基因的表达，如 CD40、CD276 和 NECTIN2（图1 E）。这证明了人类正常结肠组织和 CRC 组织中的成纤维细胞异质性，揭示了已知的 CAF 亚型，但鉴定了一种新的 CAF 簇。
为了进一步分析簇5 及其潜在的功能特征，利用基因集富集分析（GSEA），发现其中富集的基因集与干扰素反应和氧化磷酸化相关，表明这些 CAF 具有免疫反应和代谢活性（图 1 F）。进一步评估差异表达基因，注意到与免疫调节相关的其他基因，如 CD39、CD59、CAV1、MIF 和 Notch3（图1 G）。这些数据说明，簇5 成纤维细胞与癌症相关，但与已知的 CAF 亚群不同，并显示出免疫调节基因表达谱。
当比较同一患者 CRC 成纤维细胞和正常组织中簇-特征标志物的蛋白质表达水平时，发现了差异表达，证实了成纤维细胞的异质性和蛋白质组学水平上的 CAF 特异性特征。由于新发现的簇5 特别令人感兴趣，研究人员更仔细地分析了簇5 蛋白标记物 NECTIN2（CD112）的表达，发现 NECTIN2 表达仅在肿瘤微环境中发现，主要与表达 CD90 的成纤维细胞亚群共定位，但不在上皮肿瘤细胞上表达。
由于簇5 与免疫细胞和 T 细胞相互作用性状相关，因此，实验接下来分析了 CAF 标记蛋白与 T细胞相关的表达模式。结果表明，所有 CAF 相关标志物在接近 T细胞的成纤维细胞中的表达水平均显著升高。这些发现指出了 T细胞和 CAF 之间的密切相互作用，并暗示了 T细胞可能影响 TME 中某些 CAF 的募集和分布的可能性。
空间蛋白质组学分析表明，CAF 和肿瘤浸润性 T细胞之间存在密切的相互作用。因此，使用共培养试验评估了结直肠癌衍生的 CAF 对 T 细胞的影响。首先，使用流式细胞术在不同患者的原代 CAF 培养物中检测到簇5 CAF 的6个特征蛋白标记物（图2 A、B），并证实了共表达（图2 C），表明簇5 CAF 的表型在原代培养物中得以维持。
然后将原代 CAF 与 T 细胞共培养三天以表征 CAF 和 T 细胞之间的相互作用（图2 D）。尽管在整个共培养过程中不断刺激 T 细胞，但 CAF 显著降低了 T 细胞活力和增殖，证明了 CRC CAF 对 T 细胞的抑制特性（图2 E）。CD4 辅助性T 细胞显示 CD69 和 TIM-3 表达增加，其他测试标志物没有显示出明显的趋势（图2 F）。在 CD8 细胞毒性 T细胞中，CD69 和 TIM-3 在 CAF 存在下也显著上调。然而，CD25、CD137 和 PD-1 显著下调（图2 F）。这些数据表明，CAF 可以在体外破坏 T细胞的活化并抑制其增殖。
此外，分析了共培养后的 CAF 表型以评估直接 T 细胞相互作用引起的可能调节。值得注意的是，CAF 在共培养的三天内显著上调了 VCAM1 以及簇5 特异性 CAF 蛋白标记物 NECTIN2 和 CD40（图2 G），表明 T 细胞可以直接调节 CAF 的表型，正如空间蛋白质组学所揭示的那样。CD40 是 T 细胞活化标志物 CD154（CD40L）的受体，而NECTIN2 可以结合 T 细胞表达的多种受体，表明簇5 CAF 直接参与 CRC 中 T细胞反应的协调。
实验假设 CRC CAF 可以通过上调簇5 蛋白标志物 NECTIN2 和 CD40 来抑制 T 细胞增殖和活化。为了研究这些标记物的作用，在共培养实验中应用了阻断受体-配体结合的功能性抗体。在T细胞激活后，大多数T细胞获得了效应记忆或效应记忆重新表达 CD45RA 表型，而只有 20-30% 的 T 细胞表现出幼稚表型（图3 A）。与CAF的直接相互作用显著降低了 T+EM的丰度和 TEMRA细胞，而大约 60-80% 的 T 细胞保留在幼稚 T 细胞状态。此外，在抗体介导的阻断是 NECTIN2 而不是 CD40 时，CAF 的抑制作用被完全消除。
对与 CAF 共培养的 T细胞的活化和损耗标志物表达的分析显示出异常表型（图3 B）：与单独使用 T细胞相比，活化和耗竭标志物均增加。相比之下，CD40 和更明显的 NECTIN2 阻断显著降低了 CD25、TIM-3、LAG3 和 PD1 的表达，表明这两种 CAF 标志物都是抑制作用所必需的。在 CD8 T细胞中，NECTIN2 阻断的作用更为明显，表明 NECTIN2 是 CD8 T细胞耗竭的关键调节因子。虽然阻断 NECTIN2 对 T细胞活化和分化有显著影响，但 NECTIN2 受体的表达不受影响，这表明对T细胞的影响确实主要由 NECTIN2 介导。
最后，为了研究簇5 CAF 特异性基因表达的临床相关性，研究人员在1342例结肠癌患者的公开临床数据库中评估了 NECTIN2、CD40 和 CD248 的表达，发现NECTIN2 高表达患者的预后明显差于低 NECTIN2 表达的患者。同样，CD40 或 CD248 的高表达也是该患者队列中的不良预后因素。此外，NECTIN2、CD40 和 CD248 的高表达仅在 158 例微卫星稳定型（MSS）患者中与无复发生存期（RFS）的显著降低相关，而在微卫星不稳定型（MSI）高表达患者中不相关。
鉴于簇5 CAF 标志物 NECTIN2 的显著预后价值，实验测试了其表达与其他肿瘤实体临床结果的相关性，结果证实了在乳腺癌、肺腺癌、胃癌以及急性髓系白血病和多发性骨髓瘤中，高 NECTIN2 表达是患者预后不良的因素。这些数据强调了 NECTIN2 作为免疫治疗潜在靶点的临床相关性和预后价值。
综上所述，该研究认为这种新型 NECTIN2- 阳性 CAF 亚型是抑制 TME 的重要参与者，也是下一代免疫检查点抑制剂的潜在新靶点。这些抑制剂可能是一个有价值的选择，特别是在 MSS 肿瘤中。
参考文献：Agorku DJ, Bosio A, Alves F, Ströbel P, Hardt O. Colorectal cancer-associated fibroblasts inhibit effector T cells via NECTIN2 signaling. Cancer Lett. 2024 Jul 28;595:216985. doi: 10.1016/j.canlet.2024.216985. Epub 2024 May 29. PMID: 38821255.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38821255/或点击阅读原文
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