作者 | 张文萍，曾丽娇
审核 | 袁静
单位 | 深圳市第三人民医院检验医学部、感染科
课题资助：
1、“十四五”国家重点研发计划课题，课题名称：细胞因子风暴导致疾病危重症化机制研究，课题编号：2021YFC2301803
2、深圳市高水平医院建设专项经费资助
前 言
依据世界卫生组织（ WHO）的标准，实验室诊断是疟疾患者确诊和及时得到治疗的基础。目前实验室疟原虫病原学检查推荐的方法有外周血涂片镜检、首次快速疟原虫抗原检测（Rapid diagnostic test,RDT）和基因检测三种方法［1-4］，其中外周血厚、薄涂片吉氏或瑞氏染色后，显微镜油镜检测疟原虫是WHO推荐疟疾诊断的“金标准”，不仅能快速确定疟疾感染和判别疟原虫株，还能识别疟原虫期和原虫密度，协助重症疟疾救治。
快速免疫层析试纸条法（RDT法，简称“金标法”）具有检测简便、快速的特点，不同的试纸条的敏感性和特异性差异很大，其中以恶性疟原虫特有的富组氨酸蛋白（HRP2/HRP3）为靶抗原的诊断试纸对恶性疟检测敏感性和特异性较高，但不能检测其他疟原虫株；
以乳酸脱氢酶（pLDH）为靶抗原的诊断试纸条可检测恶性疟原虫或非恶性疟原虫，但不能鉴别间日疟原虫、卵形疟原虫和三日疟原虫，且对低密度原虫的检测敏感性稍差，RDT法不能监测抗疟治疗反应［5］，（目前咱们国家新研发的胶体金说是可以检测出各型的疟疾，本人做了几例比对，因为不是本案例分享的重点，附在最后面供有兴趣的同道参考）；
以 PCR监测技术为主的核酸诊断方法，近些年快速发展的宏基因检测对虫种的鉴别具有高敏感性和特异性，但受实验室条件和时间的影响，目前只有疾控中心（CDC）开展；镜检疟原虫迄今仍是确诊疟疾最快速、最直观、最经济、实用且简便，结果可靠的方法，因此识别各型别的疟原虫形态是临床检验者的技术活，笔者所在单位为深圳市收治疟疾的定点医院，深圳地理位置特殊，标本相对丰富，有责任分享给同道们。
案例经过
病史：男性患者，49 岁，发热 5 天，2018年6月17日，出现发热，最高体温 40℃，伴畏寒、寒战、乏力，服用退热药物出汗后体温可降至正常，发热时间多为中午，无明显头痛，当时无恶心、呕吐， 精神及食欲均可，前2日就诊于东莞某医院查血常规基本正常，疟原虫阴性，考虑“急性上呼吸道感染”，予口服药物治疗，但患者未服用，仅退热对症处理。
患者当年3月患“登革热”，因此2018年6月20日患者来到我院（深圳市第三人民医院）门诊就诊，体格检查基本正常。
入院后完善相关检查：
①血常规显示：WBC 8.45×109/L，N 75.1%，HGB 103g/L，PLT 87×109/L，散点图异常（粒细胞、有核红、嗜酸性粒细胞区域呈现灰区，红色椭圆圈标注），见如下检测：
图1 患者初次血常规（散点图异常）
根据散点图异常，推片、染色、镜检，发现间日疟，报告临床，进一步询问了解到患者近10 余年在柬埔寨生活，曾患疟疾。
②疟原虫检测：间日疟原虫（图2）。
图2
③镜检外周血细胞形态：厚血膜镜检找虫体（下图3），薄血膜镜检分型，形态可清晰辨认为间日疟原虫的滋养体（分大、小滋养体，其中小滋养体通常称为环状体，见图4）、配子体（见图5）及裂殖体（下图6）：
箭头所示：大滋养体（有紫红色圆形核、核周围可见蓝色的胞浆和褐色的疟色素）
箭头所示：小滋养体（也称环状体，有紫红色圆形核、核周围可见蓝色的胞浆）
图3 1例间日疟原虫感染患者厚血膜形态
（溶血瑞氏吉姆萨染色后，放大1000倍镜检）
间日疟原虫滋养体：
间日疟原虫均为环状体（小滋养体），2为一个细胞内有2个环状体
间日疟的大滋养体（可见疟色素分布不均一、细小、小杆状、黄褐色、黄中带黑）
间日疟原虫大滋养体
间日疟大滋养体，可见粗大疟色素
间日疟原虫大滋养体，每个原虫上可见2个核，寄生的红细胞胞浆内布满了相对卵形疟细小、数量多的薛氏点
间日疟原虫--图中3个大滋养体（阿米巴样，一伸一缩，胞浆含空泡，感染的红细胞体积增大）
间日疟原虫--左为环状体（小滋养体）、右为大滋养体
图4 患者间日疟原虫感染患者外周血薄血膜滋养体形态
（瑞氏吉姆萨染色，放大1000倍镜检）
间日疟原虫配子体（只需要了解有雌雄之分，鉴别雌雄意义不大）：
间日疟原虫雄配子体（红色箭头），紫红色核寄生在红细胞边缘；黄色箭头为环状体
间日疟原虫雌配子体（红色箭头），紫红色核寄生在红细胞内（偏中央）
图5 患者间日疟原虫感染患者外周血薄血膜配子体形态
（瑞氏吉姆萨染色，放大1000倍镜检）
间日疟原虫裂殖体：
间日疟原虫裂殖体
间日疟原虫--图中2个裂殖体（绿色箭头）+1个雌配子体（黄色箭头）+1个小环状体（红色箭头）
图6 患者间日疟原虫感染患者外周血薄血膜裂殖体形态
（瑞氏吉姆萨染色，放大1000倍镜检）
④登革热病毒抗体检查
图7
⑤流行性出血热病毒IgM抗体检查
图8
⑥登革热病毒抗原检查
图9
⑦生化结果
图10
治疗两天后疟原虫检查结果：金标法（+）、镜检（-）
图11
治疗三天后血常规结果：散点图恢复正常、血小板上升了20×109/L。
图12
案例分析
该患者以发热入院，血象表现散点图异常，血小板减少，近 10 余年在非洲柬埔寨生活的流行病史，当年3 月有患“登革热”，入院次日检测登革热病毒抗体检测IgM可疑、登革热病毒抗原检测(+),因此继发血小板减少症可能是登革热所致［6］。
轻度贫血是感染了疟原虫所致的轻度溶血，生化结果中胆红素均正常，但是乳酸脱氢酶略有增高，可能是疟原虫分泌的pLDH抗原，这也是用药后镜检中找不到了原虫，而金标法却能维持长达三个月阳性(+)，那是因为原虫产生的pLDH抗原与金标pLDH抗体反应形成复合物，在检测区能形成紫红色的条带，因此，我们看到金标法还是阳性（+）时，不要认为患者血液中还有活虫，以镜检和PCR结果为准。该患者在治疗的第三天，血常规的散点图也随着恢复了正常。
④治疗：予蒿甲醚抗疟原虫等对症治疗直到三次镜检结果转阴出院，并带药：青蒿素哌喹片(免费) 2片qd*2d，并叮嘱防蚊隔离。因为当时疾控中心药物短缺，未予“磷酸伯氨喹片39.6mg（22.5mg基质）qd*8d”预防间日疟复发，患者在8月23日疟疾复发。
疟原虫检测结果：
图13
复发血常规散点图再次提示疟原虫感染：
图14
经过一周的治疗后散点图恢复正常，血小板也上升到正常值。
图15
经过一周治疗后9月30日疟原虫检测结果：
图16
经过这样系统的治疗后（青蒿素类药物控制发作、磷酸伯氨喹预防复发及传播）至今未再复发，说明磷酸伯氨喹片预防间日疟复发效果好。
知识拓展
① 疟原虫感染最为常见的是间日疟原虫、恶性疟原虫感染；
恶性疟原虫的镜检外周血细胞形态：厚血膜镜检找虫体（下图17），薄血膜镜检形态可清晰得辨认恶性疟原虫的环状体、滋养体、配子体及裂殖体，镜检薄血膜分型（下图18）：
“满天星”样的环状体，每个紫红色的核旁总有蓝色的滋养体
新月形的雌配子体、蜡样形雄配子体
新月形的雌配子体、蜡样形雄配子体
厚血膜中的环状体，每个紫红色的核旁总有蓝色的胞浆
图17 恶性疟原虫感染患者厚血膜形态
（溶血瑞氏吉姆萨染色，放大1000倍镜检）
红细胞内寄生有恶性疟原虫（小环状体），其中红色箭头：1个环状体有2个核
箭头所示的红细胞内寄生有2个环状体的恶性疟原虫，其中1个环状体有2个核
箭头所示的红细胞内寄生有1个环状体拥有3个核的恶性疟原虫
红色箭头所示的红细胞内寄生有2个环状体的恶性疟原虫
恶性疟原虫环状体贴附着红细胞边缘
密度高、体积小的环状体（为小滋养体）
恶性疟原虫雌配子体形态（新月形）
恶性疟原虫雄配子体形态（蜡样形）
图18 恶性疟原虫感染患者薄血膜的各种形态
（瑞氏吉姆萨染色，放大1000倍镜检）
②、间日疟原虫形态、恶性疟原虫形态区别分享：
③疟原虫密度计算（如下摘自WS/T569-2017）:
镜检厚血膜
计数每个视野中疟原虫数和白细胞数，计数200个白细胞以上，疟原虫密度很低时，计数1000个；算出疟原虫密度：(疟原虫数量÷白细胞数量）×患者每微升血中WBC计数=疟原虫数/uL血，如果无法进行白细胞计数，外周血以8000个白细胞/微升计算。
薄血膜的疟原虫计数法
检测薄血膜，计数每个视野中的疟原虫数和红细胞数，计数1000个红细胞以上。用下式算出疟原虫密度：（疟原虫数÷红细胞数）×患者每微升血中红细胞数=疟原虫数/微升血。如果无法进行红细胞计数，则以男性5000万个/微升血、女性按450万个/微升血计算。薄血膜的疟原虫计数法适合于疟原虫密度很高时（每微升血中疟原虫数>16000个）的疟原虫计数。
④判断用药是否有效的标准：用药6小时密度下降达30%。
⑤工作中不能忽视的是卵形疟，卵形疟很少见，受感染者少见，形态有它独有的特征（见下图），市面上灵敏度高的金标法却为阴性，这给检验者尤其夜班，容易漏诊，让患者得不到及时治疗，现将我们发现的卵形疟的报告单、血常规及形态展示如下：
1、疟原虫诊断报告单：
图19
2、血常规，散点图黑色区提示不正常：
图20
3、外周血厚、薄涂片呈现的形态（如图21、22）：
注：绿色箭头卵形疟的裂殖体，红色箭头为环状体，黄色箭头为配子体
图21 卵形疟原虫感染患者厚血膜形态
（溶血后吉姆萨染色，放大1000倍镜检）
感染卵形疟的红细胞呈卵形，通常比正常红细胞大一点，红细胞边缘锯齿状，变成椭圆形，像拖粑形、扫帚状，疟色素粗大、数量少、深黄色、黄中带绿。
配子体，疟色素粗大、数量少、深黄色、黄中带绿。
寄生卵形疟的红细胞内的薛氏点相对间日疟粗大、数量少
注：红色箭头所指为配子体，绿色箭头所指为滋养体（环状体）
图22 卵形疟原虫感染患者薄血膜形态
（瑞氏吉姆萨染色放大1000倍镜检）
心得体会
检验部分
分享好的厚、薄血膜（如下图23），好的血膜制片、染色是基础和关键，制片不好，神仙也难倒，记得我在2013年在广州市CDC学习回来后，召集科室员工下班后集中学习，有空大家一起制片、切磋，当认真得制片上百时，自然就越制越好！想不好都难啊！(Practice Make Perfect!)
图23 左边为薄血膜，右边是厚血膜，磨砂边处标记编号和日期
尽管现在有许多的检测方法［1-5］，但均不能以常规简便的方法去快速发现，“金标法”灵敏度很高，是检测人体全血样本中恶性疟原虫特有的富组氨酸蛋白（HRPⅡ）和间日疟原虫特有的特异性乳酸脱氢酶(pLDH)，对首诊快速筛选恶性疟原虫和间日疟原虫患者很有帮助，市面上“金标法”普遍不能检出卵形疟和三日疟，而且它是检测代谢产物，代谢产物完全降解后才是阴性，一般治疗后会维持3个月阳性，因此，快速简便检测出卵形疟和三日疟只能通过检验工作人员制片、镜检发现，掌握镜检疟原虫的形态在大型医院和基层医院均尤为得重要。
厚血膜能提高检出率平均20倍发现疟原虫、疟色素等［7］，但制片技师是检验工作人员能力的体现，形态说来说去，制片至关重要，黄道连教授常说骨髓细胞染色的一句话：“染色没染好，神仙都难倒”，用在疟原虫的制片中可以说：“制片没制好，神仙都难倒”。
借此机会感谢广东省CDC的潘波和林荣幸教授在2013年举办的疟疾学习班，教会广东省各医院去学习检验人员制作厚、薄涂片，以及各型疟原虫的形态特征，本人学习收获很大，该文中许多的描述都是那次镜检学习期间，识别疟原虫时请教林教授给我们讲解的形态特征时的记录，虽然他现在已经退休啦，让我们记得这位鉴别疟原虫形态的传授者！
本人所在医院是深圳市收治疟疾的定点单位，制片和识别的技术必须人人过关，不能有闪失，从广州学习后组织科室成员集训，大量刻意练习制片，每个人起初都会有问题，当每个人练习到100多张片时，大致就有了感觉，接着就可以带实习学生和新员工，找到原虫报告给临床，心理上获得满足感。
经过反复练习和严格把控，10几年来我们疟疾镜检阳性率和CDC复片100%符合，在我科室里的实习生出科时都能练出一手“绝活”，因此多鼓励刚毕业的检验者加强练习，克服心理障碍，熟能生巧，本人就如何制作好厚涂片做了大量的试验，得出最佳用血量为4.6μＬ，相应的最佳直径为1.0ｃｍ，以3:7稀释、染色10min和1:9稀释、染色30均能达到最佳染色效果，便于识别疟原虫虫体，提高了检出率，具体操作可以参阅本人在《检验医学与临床》发表了一篇文章“疟原虫厚血膜制作和染色的最佳条件分析”，可在常规试验条件下推广应用［8］。
薄血膜能根据疟原虫形态分型，识别各种疟原虫的形态的工作很有价值,因此特别想分享这篇报道,我们还在新冠爆发期间发现1例卵形疟［9］。
当然，对发热和有非洲地区流行病史的就诊者多留意，即便医生未开单，我们检验者通过血常规的散点图也有发现可疑之处，发现问题，就去请教有经验的老师和向临床沟通、询问病史，我们发表在《热带医学杂志》上的一篇文章《疟疾患者外周血常规指标变化的临床意义》［10］，这篇文章被同行多次引用，伙伴们可以参考一下血常规部分指标的改变及散点图的特征。肯主动制片、镜检，当好临床的侦察兵，应用好检验技能服务好患者，形成医患良性循环，从中获得价值感。
临床治疗部分
疟疾是由疟原虫子孢子通过雌性按蚊叮咬人体感染引起的寄生虫病。临床表现为反复发作的间歇性寒战、高热、继之大汗后而缓解，可伴肝脾肿大、贫血等体征。目前引起疟疾有5种疟原虫（间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫），其中间日疟、卵形疟可复发。
我国目前主要为输入性疟疾，输入来源主要是非洲、东南亚国家，各种疟疾均有输入，以恶性疟为主，间日疟次之，部分为混合感染。针对疟疾治疗方案，除一般治疗及对症治疗，病因治疗主要以青蒿素及其衍生物控制发作、磷酸伯氨喹预防复发与传播。
重症疟疾主要由恶性疟引起，除一般治疗、对症治疗、病因治疗外，根据情况可应用糖皮质激素、血液净化治疗。非重症疟疾或无严重并发症者，只要及时抗疟治疗，预后良好，一般无后遗症，而重症疟疾病死率较高，原虫密度越高，救治时间越晚，预后越差。故如有疟疾症状或有疟疾流行区旅居史，需及时就医，主动告知旅居史，以得到及时系统诊治，以免延误病情。同时抗疟药物存在适应症、不良反应及禁忌症等，需在医生指导下使用。
志谢
撰写该短篇感谢本院袁静教授2018年发起并给与指导，我们断断续续整理了6年得以完成。主要目的是分享我们宝贵的疟原虫照片和治疗经验，常见的疟原虫形态较全面，供同道们在遇到可疑的虫体时拿起手机参照就可以放心的发报告，以及临床感染专家宝贵的治疗经验供各位同道借鉴和患者了解用药及时就诊。
袁静教授
深圳市第三人民医院感染科主任
医学博士、主任医师、教授、博士研究生/博士后导师，深圳市第三人民医院感染科主任。国家/广东省感染病临床重点专科学科带头人，深圳市感染性疾病临床医疗质量控制中心主任，深圳市常见和新发传染病防治中心主任，深圳市地方级领军人才。兼任中国中西医结合学会传染病专委会委员，中华医学会结核病学分会结核病脑膜炎专委会委员，中华医学会热带病与寄生虫病学分会虫媒传染病学组委员，广东省预防医学会副主任委员，广东省肝脏病学会肝炎专委会副主任委员，广东省医院协会传染病管理专委会副主任委员，深圳市医学会内科学专委会副主任委员。从事感染病学临床医疗工作及研究30余年，共发表高水平医学论文80余篇，编写专著8部。
参考文献：
［1］卢愈新,覃丕恩,潘茂华．等．疟疾快速诊断试剂卡与镜检及乳酸 脱 氢 酶 检 验 结 果 比 较 观 察［J］．中国医药科学，2017,7(16)：7-9．
［2］王加志，李希尚，尹授钦.等.镜检、抗原检测和核酸检测方法在疟疾诊断中的应用比较 ［Ｊ］．热带病与寄生虫学, 2020, 18 (1 ):46-48.
［3］李素华，高丽君，张雅兰，等.三种检测方法在疟疾实验室诊断中的比较分析［Ｊ］．河南预防医学杂志,2018,29( 4):252-254(转266）.
［4］WHO guidelines for malaria - 16 October 2023 - World Health Organization (WHO)
［5］国家传染病医学中心(李兰娟、张文宏、黄建荣、高琪）.疟疾诊疗指南［J］.中国热带医学,2022,22(8): 575 ~ 586.
［6］刘范伟,徐姗姗,杨益大.82例登革热患者临床资料分析［J］.山东医药,2023, 63( 26) :65-68.
［7］孙军.疟原虫色素形成的生物学意义［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2023,41(2):1-4.
［8］张文萍，张仲明，杨燕梅，罗燕婷,等.疟原虫厚血膜制作和染色的最佳条件分析［J］.检验医学与临床，2018,15（16）：2379- 2382.
［9］张仲明，符堪和，谢佳斌，余胜，余志勇，张文萍，曲久鑫，等.1例卵形疟原虫合并新型冠状病毒共感染病例报告［J］.中国热带医学, 2022,22(1):89-93.
［10］张文萍，蓝贵勉，杨曼影，张仲明,等.疟疾患者外周血常规指标变化的临床意义［J］.热带医学杂志, 2017, 17（5）:600- 603（转615）.
附：新旧试剂对比分享如下（标本少，仅供同道学术参考）
间日疟、卵形疟为-80℃保存的标本，分别保存了8个月和3个月的全血，恶性疟为新鲜血，（建议保存少量阳性全血供换“金标法”试剂时做验证用）。
说明：本文为原创投稿，不代表检验医学新媒体观点。转载时请注明来源及原创作者姓名和单位。
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编辑：徐少卿 审校：陈雪礼
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