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前言

CRISPR/Cas9技术是广泛关注的新一代基因编辑工具，学术界普遍认为基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的临床技术将为人类的健康做出巨大贡献。但是其脱靶风险一直备受关注。 研究发现，Cas9 可能会与非预期的基因组位点结合进行切割，称为脱靶效应，潜在的脱靶效应是CRISPR/Cas9系统的关键缺陷。 脱靶效应会在基因组水平上导致生物体中发生严重问题， 导致基因功能丧失，造成致命的遗传突变等。

研究人员建议采用多种方法对编辑系统的风险进行全面的分析和评估。例如，编辑系统自身特定的局限性、序列靶向的特异性、脱靶位点的分析、编辑酶的精准度和编辑效率、多靶点编辑的基因组重排、基因组突变等。随着新型基因编辑工具的不断涌现，客观上也要求鉴定靶向和脱靶位点突变的分析工具不断发展，以满足编辑效率监测的需求，推动基因编辑技术在临床疗法开发领域的落地。

上海达澈生物科技有公司经过多年技术沉淀，建立了多种基因编辑脱靶检测技术，是国内基因编辑脱靶检测的引领者，现针对基因编辑脱靶检测技术进行线上讲座，技术分享将于2024年9月11日下午14：00-15：00进行，届时欢迎各位老师和同学参加。

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参会方式

讲 座 预 告

达澈生物针对基因编辑脱靶检测的编辑系统和检测方法以及它们的工作原理，为大家带来脱靶检测技术的主题线上讲座。

主题：基因编辑脱靶检测技术介绍

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Cas9编辑系统

CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统已被开发成一种高效的基因组编辑工具。其中最常见是CRISPR/Cas9基因编辑技术。

1.组成部分：Cas9 核酸酶和向导 RNA（guide RNA，gRNA）。gRNA 通过与目标 DNA 序列互补配对，引导 Cas9 核酸酶精准地识别并结合到特定的基因组位点上。Cas9 核酸酶具有核酸内切酶活性，能够在该位点切割 DNA 双链，造成 DNA 双链断裂（double-strand break，DSB）。

2.修复方式：细胞自身的 DNA 修复机制会对断裂的 DNA 进行修复，主要有两种方式，非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）和同源重组修复（homology-directed repair，HDR）。NHEJ 修复通常会引入一些小的插入或缺失突变，可能导致基因敲除；而 HDR 则可以利用提供的同源模板进行精确的基因编辑，如插入特定的基因片段或进行点突变等。

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碱基编辑系统

第一代碱基编辑系统(base editors, BE)是在CRISPR/Cas9系统的基础上，将Cas9蛋白与一种作用于ssDNA的脱氨酶融合，在不产生DSB的情况下实现精确的点突变。目前应用最广泛的Cas核酸酶是SpCas9，具有强大的DNA靶向切割活性，但存在较高水平的脱靶编辑。迄今为止，研究人员已经开发了以下的单碱基编辑系统：

1.胞嘧啶碱基编辑系统（CBE）：主要由胞嘧啶脱氨酶和切口酶（通常是 Cas9 切口酶，nCas9）融合而成。作用时，nCas9 在目标 DNA 位点产生单链切口，胞嘧啶脱氨酶将目标位点的胞嘧啶（C）脱氨基转化为尿嘧啶（U），细胞内的 DNA 修复机制会将 U 识别为胸腺嘧啶（T），从而实现 C→T 的碱基转换。

2.腺嘌呤碱基编辑系统（ABE）：通常由腺嘌呤脱氨酶和 nCas9 组成。ABE 将目标位点的腺嘌呤（A）脱氨基转化为次黄嘌呤（I），在 DNA 复制过程中，次黄嘌呤（I）被识别为鸟嘌呤（G），从而实现 A→G 的碱基转换。

3.引导编辑系统（PE，Prime Editing）：由改造后的 Cas9 蛋白（nCas9 与逆转录酶融合）和先导编辑向导RNA（pegRNA）组成。pegRNA包含目标位点的编辑信息，引导编辑系统能够在目标位点进行精确的插入、删除或替换碱基，实现更为复杂的基因编辑操作。

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基因编辑脱靶检测技术

由于设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配，引入非预期的基因突变，即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应造成了研究中的许多不确定性，这无疑限制了该技术的应用。下面是几种常见脱靶检测技术的介绍：

1.WGS(全基因组测序)：WGS是一种评估突变的公正和直接的方法。WGS只能以高可靠性检测更高频率的脱靶位点，而缺乏在大量种群中检测脱靶位点所需的灵敏度。当对来自许多独立细胞的基因组DNA进行WGS时，它具有检测细胞或整个高等生物中所有类型的脱靶碱基编辑的潜力。

2.Digenome-seq：是一种可靠、灵敏、无偏、经济的分析包括Cas9在内的可编程核酸酶的全基因组脱靶效应方法，用于分析Cas9和其他可编程核酸酶的全基因组脱靶效应。但是Digenome-seq分析需要大量的reads，高背景噪声问题又使得识别低频脱靶突变更为困难。

3.CIRCLE-seq：该方法是一种高度灵敏且高效的体外筛查方法，与Digenome-seq识别的脱靶结果相比，CIRCLE-seq 具有更高的信噪比，而且由于其高灵敏度的特点，使用的测序reads大幅减少。

4. GUIDE-seq：原理是利用短双链寡聚核苷酸（dsODN）标记CRISPR/Cas诱导的脱靶断裂，然后对标签所在的基因组区域进行高通量测序，通过生物信息学分析从而确定脱靶位点，GUIDE-seq更精确、更灵敏。

5. DISCOVER-seq：可对细胞模型中的脱靶位点进行无偏鉴定。DISCOVER-seq已用于各种类型的Cas核酸酶。可以检测人类和小鼠细胞中多种gRNA、多种Cas核酸酶的脱靶编辑，以及其他具有大基因组的物种。

6.EndoV-seq(内切酶V测序)：EndoV-seq是一种广泛用于ABE全基因组特异性研究的方法，在体外对基因组DNA进行脱胺酶切(EndoV)，然后进行WGS。EndoV-seq已被用于评价ABE的靶向和脱靶作用，并为提高ABE的特异性提供了一些线索。

7.靶向扩增子测序：在CRISPR实验后，研究人员可以利用靶向测序来检测脱靶位点。靶向扩增子测序高度敏感，检测水平低至0. 01% （Hendel et al. 2015）。低检出率意味着，如果使用这些技术仍未被检测到，研究人员可以相对确定他们的样本没有脱靶发生。

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达澈生物优势

  • 技术全面：可针对不同需求提供多种基因编辑脱靶检测技术；


  • 经验丰富： 丰富的项目经验为客户提供全面的脱靶检测方案。

    达澈生物建立了高效成熟的基因组编辑脱靶平台，为客户提供全面精确的脱靶检测服务。包括GUIDE-seq、CIRCLE-seq、靶向测序和全基因组测序等在内的多种检测方法可供选择，以满足不同的实验需求，欢迎咨询！

公司简介

上海达澈生物科技有限公司

基因组：WGS、Circle-seq（eccDNA）；

转录组：mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA、tRNA测序；

表观组：ATAC-seq、CUT&Tag、CUT&RUN、ChIP-seq、WGBS、TBS、Hi-C；蛋白和RNA互作：RIP-seq和eCLIP-seq；

翻译组：Ribo-seq；

RNA修饰类：m6A、m1A、m7G、m5C、ac4C、Ψ假尿嘧啶、2'-O-RNA；

单细胞测序：scRNA-seq、scATAC-seq、scV(D)J-seq 空间表观转录组测序： Spatial RNA-seq 、Spatial ATAC-seq 、Spatial ATAC-RNA-seq、Spatial CUT&Tag-RNA-seq;

基因编辑脱靶检测：GUIDE-seq、CIRCLE-seq、dCas9-ChlP-seq、γH2AX-ChIP-seq、DISCOVER-seq、WGS、TRS等；