牙髓干细胞（Dental Pulp Stem Cells, DPSCs）因其具有多向分化能力和高增殖能力，成为骨组织工程研究中的潜在种子细胞。骨组织工程领域的研究重点是开发功能性骨构建物以修复大面积骨缺损。当前的策略包括使用间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）、生物材料支架和生长因子。然而，由于各种原因，这些方法在临床应用中仍存在局限性。例如，传统的2D培养的DPSCs在移植过程中难以有效生存并分化成骨细胞，从而影响骨再生的效果。
在此背景下，近年来，三维（3D）细胞培养技术被广泛应用于组织工程研究。与2D培养相比，3D培养环境更接近体内微环境，能够更好地维持细胞的生物学特性。在3D培养技术中，类器官和微球体（spheroids）的开发为提高组织再生的效果提供了新的思路。特别是利用牙髓干细胞生成的类器官样微球体，能够在保持细胞活力的同时，提供更好的细胞-细胞和细胞-基质相互作用。
为了进一步增强DPSCs在骨组织工程中的应用潜力，研究人员引入了天然产物大麻二酚（Cannabidiol, CBD）。CBD作为一种大麻素，不仅具有抗炎和抗氧化特性，还能促进MSC的成骨分化。然而，CBD在体内应用时可能会产生一定的局部和系统性副作用，因此，将其与DPSC类器官样微球体相结合，试图在提高成骨效果的同时，避免直接应用CBD可能带来的不良反应。
近日，广州医科大学口腔医学院李江团队在Communications Biology杂志发表了题为Dental pulp stem cells-derived cannabidiol-treated organoid-like microspheroids show robust osteogenic potential via upregulation of WNT6的研究论文。本研究旨在开发具有高成骨潜力的DPSC类器官样微球体，并探讨CBD处理对其成骨分化的促进作用。研究结果表明，CBD处理后的微球体在体外和体内均表现出显著的成骨潜力，其作用机制主要归因于WNT6的上调。此发现为骨缺损修复提供了一种新的、具有临床应用潜力的策略。
图示描述：
1）DPSC的分离与表征。研究人员从人类恒牙牙髓组织中分离出DPSC，并对其进行了形态学和多向分化能力的检测。图1A和1B分别展示了P0和P3代DPSC的形态学，细胞呈纤维母细胞样形态，具有较强的增殖能力。流式细胞术结果（图1C）显示，DPSC表达MSC标志物CD29、CD44、CD90、CD73和CD105，而不表达造血细胞标志物CD34和CD45。图1D至1F分别通过茜素红染色、油红O染色和阿利新蓝染色验证了DPSC的成骨、成脂和成软骨分化潜力。最后，图1G显示DPSC在7天内形成了明显的克隆。这些数据共同表明，所分离的DPSC具有MSC的典型特性，为后续实验提供了可靠的细胞来源。
2）CBD在体外促进DPSC成骨分化的效果。在图2A中，研究人员评估了不同浓度的CBD对DPSC增殖的影响，结果显示，0.1、0.5和2.5 µM的CBD在第5天显著促进了DPSC的增殖，而12.5 µM的高浓度CBD则表现出显著的细胞毒性。图2B至2E显示了不同浓度CBD对DPSC碱性磷酸酶（ALP）活性和基质矿化的促进作用。2.5 µM的CBD在第7天对ALP的活性提升效果最为显著，同时在第21天也显著促进了基质的矿化。研究人员进一步验证了2.5 µM的CBD为优化的成骨诱导浓度，并将其应用于后续实验。
3）研究团队开发了类器官样DPSC微球体并对其进行表征（图3）。利用PDMS模具制备的微孔凝胶系统，研究人员成功培养了直径约70 µm的微球体。图3A和3B展示了微球体形成过程的示意图，图3C显示了DPSC在不同时间点形成的微球体的明场图像。通过Phalloidin标记的F-肌动蛋白染色（图3D），可以观察到微球体内部的细胞骨架逐渐紧密排列，形成致密的应力纤维。活/死细胞染色结果（图3E）表明，微球体内大多数细胞是活跃的，微球体的直径在培养过程中逐渐减小（图3F），表明细胞在3D环境中的自我压缩和排列。
4）CBD对微球体内成骨标志物表达的促进作用。在第7天和第14天，CBD处理的微球体中ALP、BMP2、RUNX2、OCN和OPN的表达均显著高于未处理的DPSC或2D培养的DPSC（图4A和4B）。西方印迹结果（图4C和4D）进一步确认了这些成骨标志物在蛋白质水平上的上调。此外，免疫荧光染色结果（图4E和4F）显示，CBD处理的微球体在第14天OCN表达显著高于其他组别。以上结果表明，CBD处理的微球体具有更高的成骨潜力，这可能为骨组织工程应用提供了新的思路。
全文总结：
类器官样微球体在本研究中展现了其作为骨组织工程种子细胞的巨大潜力。首先，微球体能够模拟体内微环境，提供细胞-细胞和细胞-基质相互作用的3D结构，显著增强了成骨分化能力。此外，微球体的小尺寸（约70 µm）使其更易于均匀加载于微孔骨移植物中，避免了传统大尺寸球体导致的细胞坏死和加载困难问题。总体而言，DPSC类器官样微球体展示了其在骨缺损修复中的广泛应用前景，尤其是在避免直接应用生长因子可能带来的不良反应方面。
参考文献：Liu, Fangqi et al. “Dental pulp stem cells-derived cannabidiol-treated organoid-like microspheroids show robust osteogenic potential via upregulation of WNT6.” Communications biology vol. 7,1 972. 10 Aug. 2024, doi:10.1038/s42003-024-06655-y.
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