该文章于2024年5月7日在Nature Biomedical Engineering上发表，题目为Dendritic-cell-targeting virus-like particles as potent mRNA vaccine carriers，IF为26.8。 全文链接（DOI）： 10.1038/s41551-024-01208-4。

摘要

mRNA疫苗对树突状细胞（DCs）的特异性较差，而树突状细胞是最有效的抗原呈递细胞。我们报告了一种设计和性能改进的DC靶向病毒样颗粒，该颗粒以工程化Sindbis病毒糖蛋白为伪型，能够识别DC表面的特定蛋白，并包装了编码严重急性呼吸综合症冠状病毒2型（SARS-CoV-2）刺突蛋白或单纯疱疹病毒1型（HSV-1）糖蛋白B和D的mRNA。将靶向DC的SARS-CoV-2 mRNA疫苗注射到小鼠的足垫中，结果显示相比于未靶向的病毒样颗粒和脂质纳米颗粒制剂，获得了显著更高且持久的抗原特异性免疫球蛋白G（IgG）滴度和细胞免疫反应。这些疫苗还保护了小鼠免受SARS-CoV-2或HSV-1的感染。具有优先被DC摄取的病毒样颗粒可能有助于开发强效的预防性和治疗性疫苗。

结果

这项研究探索了病毒样颗粒（VLPs）作为mRNA疫苗载体的潜力。研究设计了一种候选的SARS-CoV-2 mRNA疫苗，包含全长刺突蛋白mRNA和来自人IgE重链的信号肽，并通过两个脯氨酸替代突变（K986P/V987P）提高了mRNA的稳定性和表达水平。为了将全长刺突蛋白mRNA包装到VLPs中，研究人员在终止密码子和polyA信号之间的3′末端插入了MS2茎环重复序列，这种设计允许mRNA通过与融合到慢病毒GagPol多肽N末端的MS2衣壳蛋白的相互作用被内化。由于水泡性口腔炎病毒G蛋白（VSV-G）包被的慢病毒可被APC有效吸收并产生具有高免疫原性的抗原，VLPs使用了包膜蛋白VSV-G进行伪型化，以增强对抗原呈递细胞（APCs）的摄取能力。通过电子显微镜分析确认了VLPs的形态和大小，并通过RT-qPCR证实了刺突蛋白mRNA的包装效率。RNA免疫沉淀实验显示，含MS2茎环的刺突蛋白mRNA特异性地被MS2衣壳蛋白拉下。进一步分析表明，VLPs中的mRNA不会被逆转录成DNA。Western blotting和共聚焦显微镜分析显示，VLPs成功地将刺突蛋白送入293T细胞，并且突变型刺突蛋白的表达效果优于野生型。对于mRNA的免疫原性测试，VLP载体的mRNA在多种细胞类型中表现出较低的先天免疫反应，这可能是因为该mRNA在细胞内产生并具有类似内源性mRNA的修饰。研究结果表明，VLPs作为mRNA疫苗载体具有潜力，尤其是它们能够低免疫原性地传递抗原mRNA，并有效地将蛋白质递送到目标细胞。

2. 含有突变S mRNA的VLPs诱导强烈和持久的刺突特异性体液应答

补充图：

为评估VLP封装mRNA作为疫苗技术的潜力，对C57BL/6J小鼠（n = 5）进行了免疫接种，使用了含突变刺突蛋白mRNA的p24 VLP（VLP–S-mut），通过脚垫注射。两周后，我们用小鼠血清进行酶联免疫吸附测定（ELISA），发现显著诱导了刺突蛋白特异性的IgG。使用含火荧光素酶的刺突假病毒进行中和实验表明，单次注射VLP–S-mut足以引发强效的中和免疫反应。通过用疫苗接种小鼠的血清预处理Huh-7细胞，几乎完全抑制了绿色荧光蛋白的荧光，而VSV-G假型的慢病毒不受影响。用活SARS-CoV-2进行的中和试验显示抗体中和效价的半最大有效浓度（EC50）为1319。此外，对B.1.617.2变异株伪病毒的中和活性分析显示，其EC50效价较SARS-CoV-2（USA-WA1/2020）变异株稍有下降。短期跟踪实验显示，疫苗接种后第7天开始检测到刺突蛋白特异性IgG，并通过加强针进一步提高了IgG反应。长期跟踪实验表明，单次接种可维持高水平的刺突蛋白特异性IgG反应长达36周。接种后没有显著的体重下降，表明VLP–mRNA疫苗的安全性。此外，鼻用VLP–mRNA疫苗能够在肺部诱导刺突蛋白特异性IgA，提示该疫苗技术可能作为鼻用疫苗来诱导粘膜免疫。通过肽微阵列分析，我们发现接种小鼠的抗体对刺突蛋白的线性表位有不同的识别强度，其中S1域和受体结合域（RBD）抗体的信号明显高于安慰剂组。热图显示，虽然表位高度多样化，但有三个表位（S2-22、S2-76和S2-83）在66.7%的接种小鼠中共享，这些表位也在多数康复小鼠中出现，并且S2-76和S2-83在不同冠状病毒中保守。

3. DVLP–S-mut mRNA在体内引发了增强的免疫反应。

本研究旨在提高病毒样颗粒（VLPs）疫苗的靶向性和免疫效果。为了实现对树突状细胞（DCs）的特异性靶向，我们将工程化的Sindbis病毒糖蛋白（SV-G）应用于VLPs，以取代广泛使用的VSV-G蛋白。通过粒径分析，我们确认SV-G VLPs的尺寸与传统的慢病毒载体相似，并且在SV-G VLPs中平均包含3.5份突变型刺突蛋白（S蛋白）mRNA。体外实验表明，SV-G VLPs能够有效地转导DCs，SV-G VLPs对DCs的转导效率显著高于对HeLa细胞的转导效率，显示出SV-G VLPs对DCs的优良靶向性。此外，与VSV-G VLPs相比，SV-G VLPs在小鼠骨髓来源的DCs（mBMDCs）中的转导效率更高，且引发了更强的CD80/CD86表达，从而促进了T细胞的激活。我们还发现SV-G VLPs具有较低的免疫原性，仅引起轻微的IFNB1表达。为了评估SV-G VLPs在体内的效果，我们将SV-G和VSV-G伪型的VLPs注射到小鼠的足垫中。结果表明，SV-G VLPs引起的淋巴结显著肿胀，表明其增强了DCs向邻近淋巴结的迁移。在体内免疫评估中，SV-G VLPs在诱导抗刺突蛋白IgG和p24特异性IgG方面显著优于VSV-G VLPs。此外，SV-G VLPs在诱导刺突蛋白特异性T细胞应答方面表现更佳，促使产生了显著更高水平的IFN-γ和TNF-α。总之，SV-G VLPs作为靶向DCs的疫苗载体显示了优越的免疫激活能力，表明其在提高疫苗效果和特异性方面具有重要潜力。

4.与LNPs相比，DVLP-S-mut mRNA改善了刺突特异性免疫应答

为了比较DVLP–mRNA疫苗与LNP–mRNA疫苗的免疫反应，我们根据已有文献制备了LNPs，并通过体外转录合成了化学修饰的SARS-CoV-2刺突蛋白编码mRNA，然后将这两种成分结合。研究结果显示，在足垫注射后12天，两种纳米颗粒均显著诱导了特异性抗刺突蛋白的抗体反应，但2μg DVLP的免疫反应明显高于LNP，无论是在2μg还是10μg剂量下。此外，我们还评估了刺突蛋白特异性T细胞免疫反应。结果显示，在疫苗接种后12天，从小鼠脾脏分离的细胞经SARS-CoV-2刺突蛋白肽库刺激后，DVLP–S-mut mRNA组小鼠的IFN-γ、TNF-α和IL-2产生的T细胞数量显著增加。相对而言，非靶向的LNP–mRNA疫苗组的特异性T细胞反应则相对较弱，与之前的研究结果一致。这些结果表明，与LNP–mRNA相比，DVLP–mRNA可能在增强体液和细胞免疫反应方面具有更好的效果。

5. DVLP的生物分布和DC靶向能力的体内表征

补充图：

为了揭示DVLPs性能提升的潜在机制，我们比较了LNPs、VSV-G VLPs和DVLPs在mRNA和蛋白质水平上的表现。研究发现，相较于非特异性的VSV-G VLPs，DVLP递送的刺突蛋白mRNA在足垫疫苗接种后显著富集于淋巴结，尽管两种VLP在注射部位的mRNA量相似。进一步分析显示，DVLP能够在体内有效靶向DCs。在接种后12小时，DVLP组的淋巴结中大多数刺突蛋白和CD11c蛋白信号共定位，表明DVLPs更有效地转导了DCs，而LNP和VSV-G VLP组的CD11c+细胞中刺突蛋白阳性细胞仅占少数。尽管DVLP递送的mRNA在淋巴结的量显著低于LNP递送的mRNA，DVLP组在淋巴结中显示了最多的刺突蛋白阳性细胞。相对而言，在注射部位，所有疫苗处理组的CD11c+细胞数量稀少，且CD11c表达水平较低。综合来看，DVLPs在体内更倾向于转导DCs，并且刺突蛋白加载的DCs能有效迁移到淋巴结。此外，组织病理学分析未发现明显的炎症细胞浸润、细胞坏死或其他组织损伤迹象，且ALT和BUN检测结果表明，LNP、VSV-G VLPs和DVLPs在小鼠体内均无显著系统性毒性。因此，所有测试的疫苗在小鼠体内均显示了良好的生物相容性和耐受性。

6. DVLP-S-mut mRNA疫苗保护hACE2转基因小鼠免受新型冠状病毒病攻击

为评估DVLP–mRNA疫苗对活病毒SARS-CoV-2的保护效果，我们对hACE2转基因小鼠进行了挑战实验。这些小鼠接受了两次1.5μg的p24 VLP–mRNA疫苗注射，随后在加强免疫接种后2周通过鼻内感染105 p.f.u.的SARS-CoV-2病毒。结果显示，接种疫苗的小鼠在第28天时体内检测到了高浓度的中和抗体，其EC50值为2643。接种疫苗的小鼠体重正常增长，而未接种的小鼠体重平均减少了2%。病毒RNA水平分析显示，DVLP疫苗组小鼠的肺部和气管中病毒载量显著降低。免疫荧光显微镜观察发现，疫苗接种小鼠的肺部几乎无法检测到SARS-CoV-2，而对照组小鼠则有明显的病毒存在。组织病理学分析通过HE染色显示，对照组小鼠肺部出现了明显的炎症反应，包括肺泡上皮细胞增生、血管内皮细胞增殖、局部肺泡缩小及炎症细胞浸润。相对而言，接种疫苗的小鼠炎症反应明显减轻，仅在极少数区域观察到轻微的炎症细胞浸润。这些结果表明，DVLP–mRNA疫苗能够有效保护小鼠免受活病毒SARS-CoV-2感染，并有效预防了挑战后的炎症反应。

7. DVLP包裹的gB1-gD1 mRNA疫苗保护小鼠免受HSV-1攻击

为了探讨DVLP作为疫苗平台的多样性，研究人员开发了一种HSV-1 mRNA疫苗，该疫苗利用SV-G伪病毒样颗粒（VLPs）传递HSV-1的gB1和gD1 mRNA。在完成基础免疫和加强免疫后，剃毛小鼠接受了HSV-1挑战。疫苗显著诱导了针对HSV-1的中和IgG，且加强免疫后抗体水平进一步提高。值得注意的是，该疫苗还表现出对HSV-2的交叉中和活性。接种疫苗的小鼠未出现严重的疾病症状或病变，而对照组小鼠则表现出明显的疾病进展。病毒载量分析显示，接种疫苗的小鼠皮肤中的HSV-1显著减少，且在背根神经节中的HSV-1水平几乎不可检测，表明疫苗提供了强有力的保护。组织学检查显示，接种疫苗的小鼠皮肤组织结构保持良好，而未接种疫苗的小鼠则皮肤真皮和表皮严重受损。免疫组织化学分析显示，未接种疫苗的小鼠皮肤中有明显的免疫反应，包括CD4+ T细胞和中性粒细胞浸润，而这些在接种疫苗的小鼠中并未观察到。这些结果确认了DVLP–mRNA疫苗在防护HSV-1感染和组织损伤方面的有效性。

总结与展望

针对 HSV-1、HSV-2、HIV 以及癌症等病毒感染的有效疫苗仍然是一个重大未满足的需求。树突状细胞（DCs）在诱导强而持久的 T 细胞和体液免疫反应中至关重要。传统的 mRNA 疫苗使用脂质纳米颗粒（LNPs），这些颗粒被多种细胞类型，包括 DCs，被动摄取。相比之下，这项研究提出了一种新方法，通过使用 VLPs 特异性地将 mRNA 疫苗靶向到 DCs，从而显著增强了体液免疫和 T 细胞反应，相较于非特异性疫苗效果更佳。这种 DVLP–mRNA 疫苗技术在 SARS-CoV-2 和 HSV-1 模型中显示了保护病毒感染的潜力。DVLPs 来源于 IDLVs，后者以其强大的免疫反应和低炎症特性而闻名，DVLPs 的优势在于避免了插入突变的风险，并且逃避了 SAMHD1 的负调控。这种靶向 DCs 的递送方法可能会提高疫苗的效力，是开发针对既有感染和癌症疫苗的有前景策略。基于DVLP的mRNA疫苗的未来应用包括原位DC疫苗，以治愈癌症或去除已建立的病毒感染，并有望与免疫检查点抑制剂联合使用。此外，DVLP–mRNA疫苗的效力可以通过使用环状RNA或自扩增RNA进一步提高，这可以提高疫苗的效力、延长抗原表达时间并降低成本。

欢迎来到医食参考新媒体矩阵

2023年疫苗接种攻略

阳过了，该怎么打疫苗？最全接种指导手册来了

撰写| 药时空

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice