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导读

心肌缺血（MI）是导致心绞痛和心肌梗死等缺血性心脏病的重要因素。心肌缺血期间产生的活性氧可引发脂质过氧化，破坏细胞结构和功能。丹参（SM）在临床上已被广泛用于治疗心血管疾病。然而，在根加工过程中，大量这种植物的地上部分通常会被丢弃。为了更好地利用这些植物资源，我们对从SM地上部分提取和纯化的酚酸进行了研究和化学转化，分析了以丹酚酸A为主的丹参酚酸成分对MI的潜在保护作用和可能机制。含有8.16 %丹酚酸A的SM茎叶总酚酸转化产物对异丙肾上腺素(ISO)诱导的急性心肌梗死大鼠模型具有较好的保护作用。它可以改善ST段的变化，具有良好的抗氧化、抗炎和抗凝作用。此外，肠道微生物群的失调以及短链脂肪酸（SCFA）、苯丙氨酸和甘油磷脂的相关代谢水平也得到了改善。这是通过降低拟杆菌属、Faecalibaculum和L-苯丙氨酸的丰度来实现的。此外，Butyricoccus、Roseburia和norank_f_Eubacterium_corpostanoligenes_group中的益生菌丰度以及丙酸和异丁酸、LPCs和PC的含量都有所增加。综上所述，SM茎叶总酚酸对ISO诱导的大鼠具有保护作用，尤其是转化后效果最强，这是预防和治疗MI的新选择。

亮点：

1.丹参茎叶总酚酸中丹酚酸A的化学转化率高达89%。

2.丹参茎叶总酚酸转化后对心肌缺血的保护作用明显优于转化前。

3.丹参茎叶总酚酸不仅能平衡机体氧化/抗氧化水平、缓解血凝、减轻炎症反应，还能维持肠道菌群平衡，通过多种代谢途径调节代谢物水平。

4.这些作用可能与其富集Butyricococcus、Roseburia等关键菌属及调控苯丙氨酸代谢有关。

论文ID

原名：Salvia miltiorrhiza stem-leaf of total phenolic acid conversion products alleviate myocardial ischemia by regulating metabolic profiles, intestinal microbiota and metabolites

译名：丹参茎叶总酚酸转化产物通过调节代谢谱、肠道菌群和代谢物缓解心肌缺血

期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

IF：6.9

发表时间：2024.06

通讯作者：段金廒&宿树兰

通讯作者单位：南京中医药大学

实验设计

实验结果

1.SMLB（转化前）和SMLA（转化后）的成分分析

我们在提取物中鉴定出8种酚酸，包括丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A和丹酚酸C（表1）。转化前SM茎叶的主要酚酸成分是丹酚酸B和迷迭香酸，含量分别为281.01 mg·g-1和35.66 mg·g−1。然而，转化茎和叶的酚酸成分主要是丹参素、迷迭香酸和丹酚酸A，含量分别为165.93 mg⋅g−1、145.22 mg⋅g−1和81.59 mg⋅g-1。丹酚酸A的转化率可达89%左右。我们采用UPLC法测定这些化合物的含量。

表1 丹参茎叶转化前后8种酚酸成分的含量（mg⋅g−1）

“-”代表没有检测到。

图1 混合对照溶液（A）、丹参茎叶总酚酸样品（B）和化学转化后样品（C）的UPLC色谱图。1、丹参素，2、原儿茶酸，3、原儿茶醛，4、咖啡酸，5、迷迭香酸，6、紫草酸，7、丹酚酸B，8、丹酚酸A，9、丹酚酸C。

2 丹参茎叶总酚酸减轻ISO诱导的大鼠心肌梗死损伤

首先，我们通过生理记录仪检测大鼠心电图变化，观察SM茎叶总酚酸转化前后对ISO诱导MI大鼠的保护作用（图2A）。与对照组相比，ISO组大鼠的心率显著增加，ST变量值显著降低（p<0.0001）。ISO组的心脏指数显著增加（p<0.0001），心肌细胞排列紊乱，间质充血和炎性细胞浸润。相比之下，SM茎叶总酚酸转化前后降低了心率和指数，调节了ST变量值（图2B），并减轻了炎性细胞浸润（图2C，D）。此外，阳性药物普萘洛尔（PR）和丹参滴丸（DSDP）对MI的改善作用低于SMLA和SMLB。这些结果表明，SMLA对ISO诱导的心脏收缩功能障碍的改善作用优于SMLB。

图2 丹参茎叶总酚酸减轻异丙肾上腺素（ISO）诱导的大鼠心肌梗死。（A）代表性超声心动图。（B）丹参茎叶总酚酸对心率、心脏指数和ST变量值的影响。（C）HE和（D）8组大鼠心肌组织的Masson染色。（A-D）数据表示为平均值±标准差，p值通过单因素方差分析进行分析。n=8，与对照组相比，####p<0.0001；与ISO组相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；**** p<0.0001。

3.凝血酶原IV功能检测

如图3所示，与对照组相比，ISO组的血浆TT、PT、APTT和FIB存在显著差异（p<0.01）。DSDP组能有效延长TT、PT凝血时间（p<0.05），降低FIB含量（p<0.0001）。SMLA在延长APTT凝血时间和降低血浆FIB水平方面比SMLB更有效。

图3 凝血项的结果。数据表示为平均值±标准差，p值通过单因素方差分析进行分析。n=8，与对照组相比，##p<0.01，####p<0.0001；与ISO组相比，*p<0.05，**p<0.01，**** p<0.0001。

4. 生化指标测定

如图4A所示，与对照组相比，ISO组AST、ALT、CK、CK-MB、CR、LDH、尿素、MDA、IL-6和TNF-α显著升高，而GSH-Px、SOD和CAT显著降低（p<0.05）。在药物处理组中，这些指标恢复到正常水平（p<0.05）。这些影响在SMLA组中最为明显（图4B）。

图4 相关生化指标的测定及相关性分析。（A）丹参茎叶总酚酸对生化指标的影响。（B）组间指标聚类热图。数据表示为平均值±标准差，p值通过单因素方差分析进行分析。n=8，与对照组相比，p<0.05，##p<0.01，#### p<0.0001；与ISO组相比，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001，**** p<0.0001。

5. ISO诱导心肌梗死大鼠血清、盲肠内容物和心脏组织的代谢变化及SMLA治疗的影响

我们通过UPLC-Q/TOF/MS在正离子和负离子模式下分离每组的血清、盲肠内容物和心脏组织样本，数据通过QI和SIMCA 14.1软件进行分析。我们对对照组和ISO组大鼠血清、盲肠内容物和心脏组织代谢谱数据的模式进行PCA分析（图5A），结果表明，与正常大鼠相比，MI大鼠存在代谢异常。我们从OPLS-DA分析后构建的S图中提取了潜在的相关标记（图5B，C），我们进一步分析以鉴定生物标志物。与正常大鼠相比，我们在MI大鼠中鉴定出19种血清、15种盲肠内容物和19种心肌组织内源性代谢物（表2）；随后，对差异代谢物的药物调控研究发现，SMLA可以逆转MI发生显著变化后14种差异代谢物的变化（图6A、B、C）。因此，L-苯丙氨酸和溶血磷脂酰胆碱（LPCs）等代谢产物被认为是SMLA调节MI的关键代谢产物。

表2 潜在生物标志物鉴定结果

a VIP值>1。

b趋势为模型组vs对照组：↑，增加；↓, 减少。

图5 （A）异丙肾上腺素（ISO）组（黄色）与健康对照组（红色）在正（标签1,2,3）和负（标签4,5,6）离子模式下的血清样本（标签1,4）、盲肠内容物样本（标签2,5）和心脏组织样本（标签3,6）的PCA评分图、（B）OPLS-DA评分图和（C）S图。

MetaboAnalyst 5.0用于分析转化前后SM茎叶总酚酸变化的最重要代谢途径。研究发现，在药物作用前，53种差异代谢物与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、鞘脂代谢和甘油磷脂代谢途径有关（图6D）。药物作用后，14种关键代谢产物主要影响苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、鞘脂代谢、苯丙氨酸代谢和甘油磷脂代谢。其中，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及苯丙氨酸代谢的相关性最强（图6E）（p<0.05，影响>0.3），表明两种代谢途径是SMLA治疗MI的关键途径。

图6 SMLA调节的关键差异代谢物和关键代谢途径。（A）血清中的关键差异代谢物。（B）盲肠内容物中的关键差异代谢物。（C）心脏组织中的关键差异代谢物。（D）与心肌缺血（MI）相关的潜在代谢途径。（E）SMLA调节的关键代谢途径。数据表示为平均值±标准差，p值通过单因素方差分析进行分析。n=6，与对照组相比，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，####p<0.0001；与ISO组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.01，**** p<0.0001。

6. SMLA促进ISO诱导的MI大鼠肠道SCFA释放

我们通过GC-FID测定ISO诱导的大鼠盲肠内容物中六种SCFA的水平。与对照组相比，ISO处理显著降低了盲肠内容物中AA、PA、IBA、BA、IVA和VA的浓度（p<0.0001）。SMLB处理后，ISO组大鼠盲肠内容物中六种SCFA的水平显著升高（p<0.05）。然而，在SMLA存在的情况下，PA和IBA的含量趋于增加（p<0.05）。PR和DSDP处理后，大鼠SCFA含量没有显著增加（p>0.05）（图7）。

图7 短链脂肪酸（SCFA）产生对大鼠盲肠内容物的影响。数据以平均值±标准差表示，n=6。与对照组相比，####p<0.0001；与ISO组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

7. SMLA调节ISO诱导的MI大鼠肠道菌群失调

为了研究SMLA对肠道菌群的调节作用，我们对所有处理组的盲肠内容物样本进行了16S rRNA测序。肠道微生物群的α多样性分析表明，SMLA组的丰度和多样性高于SMLB组（图8A）。接下来，我们进行了beta多样性分析，以探索不同组之间群落组成的相似程度。PCA和PCoA分析显示，对照组和ISO组之间的距离更大，物种组成差异更大，表明ISO诱导的MI疾病状态下大鼠的肠道菌群发生了显著变化。给药后，它在一定程度上偏离了ISO组，接近对照组，表明该药物在某种程度上改善了MI大鼠肠道菌群的多样性（图8B）。

接下来，我们检查了不同分类水平的肠道微生物群的相对丰度（图8C，D）。在门水平上，与对照组相比，ISO诱导了拟杆菌门和放线菌门的增加，但厚壁菌减少。然而，药物作用增加了厚壁菌的丰度，减少了放线菌（图8C）。在属水平上，与对照组相比，ISO组的Dubosiella和Allobaculum丰度增加，乳杆菌减少。然而，药物作用增加了乳杆菌的丰度，降低了Dubosiella的丰度（图8D）。

为了进一步确定影响MI的关键细菌，我们分别在门和属水平上通过Wilcoxon秩和检验对正常和MI大鼠的肠道细菌进行了比较分析。结果表明，Actinopbacteriot是导致ISO组肠道菌群失衡的关键细菌门（图8E）。在属水平上，我们鉴定出影响MI的15个关键细菌属，包括Dubosiella（图8F）。通过比较不同组之间上述15个关键属的丰度，我们最终筛选出5个不同的属（图8G）。其中包括Roseburia和拟杆菌属，前者在SMLA组中显著增加，后者在SMLA治疗组中显著减少，它们被确定为SMLA治疗MI的关键属。

图8 SMLA给药对异丙肾上腺素（ISO）诱导心肌梗死大鼠肠道微生物群的影响。（A）alpha多样性分析。（B）beta多样性分析。（C）按门划分的微生物群落柱状图。（D）按属划分的微生物群落柱状图。（E）基于Wilcoxon秩和检验分析对照组和ISO组之间的门水平差异。（F）基于Wilcoxon秩和检验分析对照组和ISO组之间的属水平差异。（G）SMLA对5种关键细菌的调控。数据以平均值±标准差表示，n=6。与对照组相比，####p<0.0001；与ISO组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，**** p<0.0001。

8. 相关性分析

心肌梗死导致细胞膜通透性增加，进而导致心肌酶作为心肌梗死的标志物释放到血清中。此外，心脏中氧自由基的增加也会导致血管内皮细胞损伤。反过来，SCFA结构和肠道微生物群的变化会影响MI宿主的代谢类型。因此，我们使用Spearman相关性分析来探索肠道菌群与心脏酶、抗氧化因子、SCFA和代谢物之间的相关性（补充图S1）。

基于这些结果，Cytoscape 3.9.0软件构建了SMLA给药后差异表达的心肌酶、抗氧化因子、SCFA、关键属和关键代谢物的共表达网络（图9）。该网络涉及4种心脏酶、4种抗氧化因子、6种SCFA、5种关键肠道细菌和14种关键代谢产物，包括苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成和β-丙氨酸代谢。共表达网络显示苯丙氨酸代谢与Butyricicoccus、Roseburia和norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group呈强负相关，表明它们可能降低L-苯丙氨酸浓度。此外，甘油磷脂代谢与这三个属呈强正相关，表明上述细菌可以富集参与甘油磷脂代谢途径的溶血磷脂和磷脂酰胆碱等代谢产物。SCFA和抗氧化因子与这三个属呈正相关，而心肌酶与它们呈负相关。上述结果表明，在有限的样本中，SMLA可以通过增加Butyricicoccus、Roseburia和norank_f_Euberrieumcocorostanoligenes_group细菌的丰度，增加抗氧化因子和SCFA的释放，改善甘油磷脂代谢水平，降低心肌酶含量，进一步降低L-苯丙氨酸的代谢水平，在治疗MI中发挥重要作用，但这一结论需要在更大的样本中进一步验证。

图9 关键属和关键代谢物之间的共表达网络在SMLA作用后显示出差异表达。菱形代表不同的属，圆圈代表不同的代谢物和临床因素。

ISO导致心肌缺血和缺氧，是心肌梗死损伤的常用模型之一，其病理生化和形态学变化与人类相似。在这项研究中，ISO建模后，大鼠心率加快，呼吸急促，长时间缺血导致代偿性左心室肥大。因此，ISO组的心脏器官指数明显较高。ISO组心电图结果显示，ST段下降表明心内膜缺血性损伤。心肌缺血和缺氧导致心肌损伤和膜通透性增加，使心肌酶释放到血清和血浆中。因此，ISO组的AST、LDH、CK和CK-MB水平显著降低。SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶构成了人体抵御自由基引起的氧化损伤的防御系统，以维持体内的氧化/抗氧化平衡，心肌梗死后耗氧量增加，并产生大量氧自由基。ISO组SOD、CAT和GSH-Px活性显著降低，MDA含量升高。此外，心肌细胞合成并分泌IL-6和TNF-α等炎症因子，刺激血管内皮细胞和白细胞的表达，促进心肌炎症损伤。在我们的研究中，ISO组的IL-6和TNF-α水平升高。颈后皮下多点注射异丙肾上腺素可刺激心脏β受体，导致血小板聚集，加速血栓形成，加重心肌梗死程度。与正常组相比，ISO组的TT、PT和APTT显著缩短，FIB水平升高。药物干预后，阳性药物DSDP对MI损伤的保护作用优于PR组。SM茎叶转化前后总酚酸可保护心肌和血管内皮细胞，高剂量组的效果优于低剂量组。SMLA组由于丹酚酸A相对含量的增加，显著改善了ISO诱导的MI大鼠的ST段变化，降低了心肌损伤酶的血清含量，保护心肌细胞免受氧化损伤，并具有明显的抗MI作用，这可能与平衡身体的氧化和抗氧化系统以及减少炎症因子分泌的机制密切相关。

血清、盲肠内容物和心脏组织中代谢物的变化可能表明SM茎叶总酚酸转化前后对MI的潜在治疗和保护作用。先前的研究表明，心肌梗死后血清苯丙氨酸水平显著升高。苯丙氨酸是一种必需氨基酸，酪氨酸前体，与心肌梗死的发展密切相关。SMLA干预后，L-苯丙氨酸水平显著下调。LPC是甘油磷脂的代谢产物，是动物细胞膜的主要成分，其水平反映了组织病理生理变化。LPC通常被认为参与了体内的氧化应激过程，加重了心血管内皮损伤。然而，也有研究表明，LPC和磷脂酰胆碱（PC）可以防止对抗氧化酶的过度损伤，并具有抗氧化作用，在缺氧或局部缺血期间，心脏组织中的PC合成受到抑制作用的抑制，水平降低。此外，在肠道微生物群出现生态失调的情况下，某些细菌会过度生产磷脂酰胆碱和胆碱，形成三甲胺-N-氧化物（TMAO）。TMAO水平升高与动脉粥样硬化、心肌梗死、血栓形成和中风的风险增加有关。在这项研究中，LysoPC（18:1（9Z）/0:0）、LyzoPC（22:6（4Z、7Z、10Z、13Z、16Z、19Z）/0-0）、PC（20:4（8Z、11Z、14Z、17Z）/18:0）、PC（22:2（13Z、16Z）/14:1（9Z））和LysoPC（15:0/0:0）在SMLA作用后显著上调。PC（18:2（9Z，12Z）/20:4（5Z，8Z，11Z，14Z）），PC（16:0/20:4（8Z，11 Z，14Z，17Z））和PI（18:1（9Z）/20:4（5Z、8Z、11Z、14Z））显著下调，提示SMLA可能通过调节苯丙氨酸代谢和甘油磷脂代谢途径在MI中发挥治疗作用。

短链脂肪酸（SCFA）在肠道微生物群的代谢中起着重要作用，它们是肠道益生菌发酵膳食纤维产生的代谢产物。研究表明，SCFA不仅有益于肠道健康和免疫系统，还与心血管疾病有关。SCFA可能通过调节炎症反应来保护心脏。此外，它们可以作为心肌细胞的能量来源，提供心脏所需的能量，并有助于维持心脏功能。在这项研究中，服用SMLA后，SCFA、PA和IBA水平显著升高，表明SMLA可能通过减少炎症反应和提供能量代谢的能力来保护心脏。

越来越多的研究表明，肠道菌群失衡可能与心肌梗死的发生和进展有关。在我们的研究中，在门水平上，在疾病状态下，拟杆菌门和Actinopbacteriot的数量显著增加，但厚壁菌门的数量明显减少。然而，SMLA阻碍了这些变化。在属水平上，SMLA处理后，Butyricoccus、Roseburia和norank_f_Eubacterium_corpostanoligenes_group的丰度显著增加。据报道，Butyricoccus是一种产生丁酸的肠道益生菌，在肠道微观世界中起着重要作用。此外，Roseburia可能有助于维持肠黏膜的健康，增强肠黏膜屏障的功能，防止有害物质和微生物进入循环，从而降低心血管系统受损的风险。在SMLA存在的情况下，拟杆菌与Faecalibaculum的丰度显著降低。虽然拟杆菌通常与肠道保持有益的关系，但它们也可以转化为具有致病性的病原体。总之，SMLA可能以一种新的方式作为益生元，通过调节肠道菌群来保护正常的心脏功能。

结论

综上所述，SM茎叶总酚酸对ISO诱导的大鼠心肌梗死具有显著的保护作用，其中SMLA的保护作用最强，是预防和治疗心肌梗死的新选择。上述结果表明，SMLA不仅可以平衡体内的氧化/抗氧化水平，缓解凝血和减少炎症反应，还可以通过多种代谢途径平衡肠道菌群并调节代谢物水平。这些功能可能与SMLA富含Butyricoccus和Roseburia等关键属以及苯丙氨酸代谢水平的调节有关。这些可能是SMLA治疗心肌梗死的潜在靶点。本研究为SMLA治疗心肌梗死的潜在分子机制提供了全面深入的见解，有望成为一种新的治疗方法。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38941891/

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