作者 | 张晓煜
单位 | 中国医学科学院肿瘤医院深圳医院
一 、前言
近年来，碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌（carbapenem resistant Enterobacteriaceae,CRE）在全球范围内快速播散，被列为严重威胁人类健康的“紧急威胁”级病原菌[1]。
肿瘤患者由于接受化疗、放疗、免疫缺陷、长期反复使用广谱抗菌药物，是CRE感染的高危人群。感染CRE预后差，有效治疗药物有限，成为当前抗感染领域的棘手问题。我们通过一例55岁女性肿瘤患者的病例，探讨CRE感染的实验室诊断和综合治疗策略，为临床提供参考。
二、 案例经过
1、主要病史
女性患者，55岁，52岁绝经后出现阴道不规则出血，持续3年，伴随腰骶部酸痛、漏尿、便秘等症状。
2023年6月14日，于外院检查，经直肠彩超显示宫颈增大并有实性团块，大小约10cm×6.6cm×7.3cm，考虑为宫颈癌。阴道镜检查发现阴道多发病变，侵及阴道口近会阴处。
活检病理结果为乳头状鳞状细胞癌。结合病史、体查及相关检查，明确诊断为宫颈癌。为进一步治疗，患者于2023年6月19日入住我院放疗科，计划进行放射治疗。
2、诊疗经过
入院后，患者仍有间断性阴道流血，伴腰骶部酸痛和漏尿。肾功能检查显示肌酐（159μmol/L）升高，尿沉渣检查显示红细胞（105.40个/μl）升高，粪便隐血阳性，可能与巨大肿瘤压迫肾脏、膀胱、肠道有关。
2023年6月30日开始放射治疗，阴道出血量逐渐减少，少许阴道流液，腹痛控制良好。2023年7月11日开始同步卡铂周方案化疗。至2023年7月17日，共行放疗13次，卡铂治疗1次。
2023年7月18日夜间，患者无明显诱因出现发热，最高体温38.8℃，伴左下腹阵发性绞痛，阴道少许流血，流液较前增多，小便量减少。
急查血常规结果显示：中性粒细胞百分比（Neut%）77.8%↑，血红蛋白（Hb）74g/L↓，降钙素原（PCT）0.150ng/ml↑，C反应蛋白84.76mg/L↑，肝肾功能正常，同时送检血培养。
2023年7月19日，患者发热未控，临床送检患者阴道分泌物至微生物室培养。同时在导尿过程中见尿液中大量沉渣，尿沉渣检查显示沉渣白细胞（3293.3个/μl）升高，沉渣红细胞（60.2个/μl）升高，细菌量（3061.00个/μl）升高，行亚甲蓝试验结果为阴性，排除膀胱瘘。
2023年7月20日，盆腔CT显示宫颈肿块累及阴道下1/3，阴道直肠陷窝，膀胱后壁及直肠肠壁。
根据患者检查结果，2023年7月18日首次发热时送检的血培养暂未报阳（7天后回报结果为阴性），尿沉渣提示大量血尿及细菌尿，不排除泌尿系感染。考虑哌拉西林以原型药形式通过肾脏排泄，临床予哌拉西林他唑巴坦4.5g Q8h抗感染。
2023年7月22日，病区接到微生物室多耐药报告：阴道分泌物培养出大肠埃希菌（++++），为CRE，合并粪肠球菌（+++）感染。
3、实验室检查结果
（1）鉴定药敏试验：2023年7月19日，检验科微生物室接到放疗科患者阴道分泌物培养标本，经35℃培养18小时后，血平板生长两种菌落，分离菌经VITEK MS质谱仪鉴定为大肠埃希菌和粪肠球菌，置信度为99.9%。
在细菌鉴定药敏仪Vitek 2 Compact系统分别采用AST-N334和AST-P639药敏卡执行药敏试验。2023年7月21日，药敏结果显示大肠埃希菌为CRE，仅对阿米卡星和复方新诺明敏感，替加环素和左氧氟沙星中介，其他抗菌药物均为耐药。结果见图1。
图1 Vitek 2系统大肠埃希菌药敏结果
（2）替加环素药敏结果复核试验：替加环素是多重耐药和泛耐药革兰阴性杆菌的常用治疗选择，多采用联合用药。依据AST-N334试剂说明书，替加环素由于在进行比较性试验时无耐药菌株，AST卡片检测替加环素耐药性的能力尚不清楚。
当肠杆菌目细菌替加环素结果为中介和耐药时，需采用其他方法进行复核。本例CRE替加环素结果显示中介，本实验室分别采用肉汤稀释法、纸片扩散法（K-B法）和E-test法进行了复核，结果见表1和图2，结果判读采用美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）标准。
图2 替加环素药敏复核结果A:K-B法药敏结果；B:E-test药敏结果；C:肉汤稀释法药敏结果
表1替加环素药敏复核结果
因微量肉汤稀释法目前被认为是检测替加环素体外药敏试验的金标准，因此本最终报告使用替加环素肉汤稀释法结果（2μg/ml），报告为敏感。
（3）左氧氟沙星、阿米卡星及复方新诺明药敏结果复核实验：2021年3月，全国细菌耐药监测网发布自动化药敏系统中喹诺酮类对肠杆菌目细菌检测中介率升高的情况[2]，强烈建议使用自动化药敏系统检测出现左氧氟沙星结果中介时，采用肉汤稀释法、纸片扩散法（K-B法）或E-test法等非自动化药敏系统方法进行复核。
本例CRE左氧氟沙星仪器结果显示中介，我室常规采用纸片法复核，结果显示左氧氟沙星抑菌圈为26mm，依据CLSI折点判读为敏感。
由于CRE广泛耐药的特点，临床治疗选择极其有限，我室针对药敏结果中敏感的阿米卡星和复方新诺明亦采取了纸片法复核，结果显示抑菌圈直径分别为20mm和30mm，依据CLSI折点判读为敏感。
（4）碳青霉烯酶检测实验：采用碳青霉烯酶胶体金试剂检测该株CRE碳青霉烯酶型，结果显示为NDM型（图3）。
图3 碳青霉烯酶酶型检测结果（NDM型）
4、治疗结果
根据检验药敏报告，结合ICU、肿瘤内科会诊意见，2023年7月22日，临床调整治疗方案为替加环素首次100mg，后续50mg q12h；阿米卡星首次0.8g，后续0.6g qd。一周后，患者体温逐渐恢复正常。
2023年7月25日复查阴道分泌物培养，未生长大肠埃希菌及粪肠球菌，仅见少量链球菌及凝固酶阴性葡萄球菌，治疗效果显著。10天后，患者停用替加环素和阿米卡星，于2023年8月17日完成化疗治疗出院。
三、案例分析
本案例通过一例肿瘤患者感染CRE的实验室检测，为临床提供精准的药敏结果策略和经验，以期为临床使用抗菌药物、实验室工作提供实用的依据和资料。
1、 药敏结果的复核
（1）替加环素：依据《多黏菌素类与替加环素及头孢他啶/阿维巴坦药敏方法和报告专家共识》[3]，替加环素的药敏试验方法包括以下3类：
①金标准BMD法，其操作复杂且耗时长；
②E-test法：MIC值偏高，尚未在我国获批。但从本案例的试验结果：E-test与肉汤稀释法结果相近，是否可靠，还需更多验证。
③Vitek 2系统，其替加环素药敏结果在验证阶段缺少足够的耐药株，MIC值偏高，假耐药株多。
本案例中，由于Vitek 2系统的替加环素结果提示中介，我们采用了三种方法复核，结果显示K-B法为耐药，而E-test和肉汤稀释法结果均为敏感。
替加环素的理化性质不稳定，容易受光线或空气影响，因此不推荐纸片法作为常规复核方法。美国临床实验室标准化协会（CLSI）未提供替加环素药敏折点，对肠杆菌目细菌的药敏折点推荐使用FDA标准。
替加环素通常用于治疗CRE所致的医院获得性肺炎、皮肤软组织感染和腹腔感染，常与多黏菌素、碳青霉烯类、氨基糖苷类等联合使用[1]。
依据2023年上半年CHINET数据[4]，替加环素对肠道菌群的耐药率较低，耐药率为2.3%，耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌耐药率为3.5%。在本病例中，替加环素联合阿米卡星治疗有效，证实体外药敏结果可靠。
（2）左氧氟沙星：2021年，全国细菌耐药监测网建议使用自动化药敏系统检测肠杆菌目出现左氧氟沙星结果中介时，采用肉汤稀释法、K-B法或E-test法等非自动化方法复核。
我室在使用Vitek 2系统执行药敏时，同步使用K-B法复核，结果显示为敏感，为临床提供了可靠的用药指导。
（3）超广谱β内酰胺酶（ESBLs）结果报告：Vitek2系统使用的AST-N334药敏卡，对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌报告ESBL结果，其原理为同时使用头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶分别单独和联合使用棒酸，系统评估三组药物加与不加棒酸的生长百分比差异来判读ESBL的阴阳性。
由于CRE产生的碳青霉烯酶可水解头孢菌素且对除阿维巴坦外各类酶抑制剂完全不敏感[5]，因此在加与不加棒酸的药物间生长百分比无差异，ESBL检测结果显示为阴性。
CRE除了产生碳青霉烯酶外，还有其他非特异性耐药机制：如其他β内酰胺酶的产生、孔蛋白丢失和外排泵过度表达。这些机制通常互补或与碳青霉烯酶的产生相关[6]。因此，CRE常携带多种ESBLs，对于CRE的药敏报告中的ESBL的阴性结果建议删除，避免对临床产生误导。
2、 酶型的检测
由于不同种类的抗菌药物对产生不同碳青霉烯酶菌株的体外抗菌活性不同，因此准确、快速地对CRE产生碳青霉烯酶进行检测并分型，对于临床抗感染治疗的精准用药和医院感染预防控制具有重要的价值[7]。
目前实验室检测碳青霉烯的方法分为表型检测和基因型检测，其中mCIM和eCIM在常规检测方法中推荐级别高，酶免疫层析（金标法）技术推荐级别为中。mCIM和eCIM因其所需要试剂简单，成本较低，较为容易在实验室常规开展，但其检测时间较长。
酶免疫层析技术（金标法）需采购专用试剂，其优势在于可以特异性检测碳青霉烯基因型，15min即可判读结果，可实现快速报告。我室使用金标法试条，可快速同时检测KPC、NDM、OXA-48、VIM和IMP共5种碳青霉烯酶基因，其特异灵敏度和特异度均在90%以上。
本案例中该株CRE结果显示为NDM型，可提示临床产该酶的CRE菌株通常仅对替加环素、多黏菌素和氨曲南-阿维巴坦等敏感，少数单产金属酶菌株对氨曲南敏感，可以协助临床尽早启动有针对性的抗感染治疗。
3、 感染途径
该患者阴道分泌物中的CRE从何而来，引起了笔者的思考，常规阴道分泌物作为有菌标本一般不做细菌培养，而本院为肿瘤专科医院，开具此类医嘱的患者多为经阴道手术后或阴道被肿瘤组织侵犯者，易发生感染。
本例患者入院即有阴道流血，放疗后阴道流血症状缓解，有少量阴道流液。结合患者发热表现及感染指标升高，而血培养为阴性，临床考虑感染源可能为阴道。患者阴道分泌物中生长大量大肠埃希菌和粪肠球菌，这两种菌均为常见的肠道菌群。
CRE感染与肠道微生态及其定植是近年来研究的热点，本案例中患者CT提示宫颈不规则肿块累及邻近直肠肠壁，不排除阴道直肠瘘形成，且放疗后出现大便次数增多副反应，该患者是否在多重因素下造成肠道菌群易位，有待更多证实，直肠拭子筛查或许是良好的验证途径。
四、总结
综上，本实验室在各类专家共识的指导下，结合临床实践，通过多种方法验证一例CRE的药物敏感试验结果及碳青霉烯酶型，向临床提供了准确有效的实验室依据，对迅速调整抗感染治疗和及时采取院感措施起到了关键作用。
提示微生物工作者，提供治疗CRE的关键药物MIC结果及碳青霉烯酶酶型的筛查，对加速有效治疗和实现精准防控具有重要价值。
五、专家点评
点评专家：张丽 中国医学科学院肿瘤医院深圳医院 副主任技师
2024年5月17日，世界卫生组织发布了最新细菌优先病原体预警清单，其中碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌（CRE）被列为关键优先级组，提示CRE感染形势依然严峻，需引起微生物学工作者及临床医生的高度重视。
本案例通过对一例肿瘤患者CRE感染的详细分析，包括临床特点、药敏结果复检思路、结果分析及酶型检测等，提供了详实的数据和科学的依据，为临床采取有效的抗感染药物治疗和院内感染防控措施提供了有力支持。
本案例展示了实验室检测在临床治疗中的关键作用，强调了药敏结果复核和酶型检测的必要性。通过多种检测方法和与临床的紧密合作，我们能够提供准确的实验室依据，支持临床迅速调整抗感染治疗方案和采取有效的院感防控措施。
未来的研究应继续关注CRE的早期诊断方法和预防措施的研究，以提高治疗效果和患者预后。
参考文献
[1]中国碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染诊治与防控专家共识编写组.中国碳青霉烯耐药 肠杆菌科细菌感染诊治与防控专家共识[J].中国医学杂志，2021,101(36)：2850-2860.
[2]全国细菌耐药监测网.重要提示：自动化药敏系统结果中喹诺酮类对肠杆菌目细菌检测中介率升高的情况通报[EB/OL].(2021-03-11)[2023-09-27].http://www.carss.cn/Notice/Details/782.
[3]中国医疗保健国际交流促进会临床微生物与感染分会,中华医学会检验医学分会临床微生物学组，中华医学会微生物学与免疫学分会临床微生物学组.多黏菌素类与替加环素及头孢他啶/阿维巴坦药敏方法和报告专家共识[J].中华检验医学杂志,2020,43(10):964-972.
[4]全国细菌耐药监测网.CHINET 2023年上半年细菌耐药监测结果[EB/OL].(2023-08-28)[2023-09-27].http://www.chinets.com/Document.
[5]β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用专家共识编写专家组.β-内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂临床应用专家共识[J].中华医学杂志,2020,100(10):738-747.
[6]Beatriz Suay-García, María Teresa Pérez-Gracia. Present and Future of Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae (CRE) Infections[J].antibiotics,2019,8,122.
[7]喻华,徐雪松,李敏,等.肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识（第二版）[J].中国感染与化疗杂志,2022,22(4):463-474.
说明：本文为原创投稿，不代表检验医学新媒体观点。转载时请注明来源及原创作者姓名和单位。
近期视频推荐
编辑：李玲 审校：陈雪礼
热门跟贴