如何利用遗传学工具操控神经元的活动，进而研究动物行为的机制是神经科学领域非常重要的问题。目前广泛应用的遗传工具主要有光遗传学工具 （光敏感离子通道） 和基于GPCR的化学遗传学工具DREADDs。虽然这些已有的工具可以调控钠、钾、氯等离子的跨膜流动，但是目前尚没有可以直接控制在多个生命过程中发挥重要作用的钙离子的遗传学工具。为了拓宽化学遗传学工具的种类和应用领域，获得可以调控钙离子流动的遗传工具，针对可以通透钙离子的离子通道进行理性改造是有潜力的化学遗传学工具开发策略。
近日，来自浙江大学基础医学院生物物理学系的杨帆团队和浙江大学脑科学和脑医学院学院的崔一卉团队在Protein & Cell杂志发表题为RADICAL: a rationally designed ion channel activated by ligand for chemogenetics的论文。此研究基于具有较高钙离子通透性的瞬时受体电位M8离子通道（TRPM8），开发了化学遗传学工具RADICAL，可以被环己醇（CHXOL）特异地激活。
为了验证该工具在神经系统中的应用价值，研究人员分别开发了能在神经元或胶质细胞里表达RADICAL的遗传工具，并且在不同的脑区和行为中检测了该遗传工具的效应。结果表明，激活表达在前额叶皮层边缘下区 （IL） 神经元的RADICAL可以显著增强恐惧记忆消退；激活表达在腹侧被盖区 （VTA） 星型胶质细胞的RADICAL则可诱导小鼠自发活动显著增加。
薄荷醇是TRPM8通道的经典激动剂，其结构类似物CHXOL则对TRPM8无激活作用。本团队的前期研究表明【1】，薄荷醇激活TRPM8通道的分子机制为其羟基与通道的R842残基形成氢键相互作用，异丙基和甲基分别与通道的I846和I843形成范德华力相互作用，从而结合并使通道打开。而环己醇因缺少异丙基和甲基，因此无法打开野生型 （WT） 的TRPM8通道。
为了改造TRPM8通道使CHOXL能够激活TRPM8的特定突变体，研究者设想将I846位点突变变成侧链更大的疏水性氨基酸后，可能弥补薄荷醇上的异丙基缺失 （CHOXL缺乏该异丙基） 导致的互作减少，从而使通道响应CHOXL的刺激。点突变和电生理的结果显示，将I846突变成苯丙氨酸（F）后，突变的通道确实可以被CHOXL激活，而将I846突变为侧链较小的甘氨酸（G），丙氨酸（A）或侧链类似的亮氨酸（L）则无法被CHOXL激活。
为了进一步在静息膜电位下提高CHOXL对I846F点突变的激活效应，研究者引入了另一个点突变I985K，I846F-I985K双点突变可使通道的电压激活曲线显著左移。重要的是，当细胞膜电位钳制在-80 mV时， CHXOL可引发明显的内向电流，表明在静息膜电位下，CHXOL可诱导细胞膜的明显去极化。同时，双突变通道仍然保持对钙离子高通透性，因此研究者获得了基于TRPM8双突变通道和配体CHXOL的化学遗传学工具RADICAL。
接下来，研究者进一步探索了RADICAL是否可以在体内实验中通过操控神经元的活性从而引发小鼠行为学的变化。在啮齿类动物中，大脑前额叶皮层边缘下区 （IL） 神经元的激活可促进恐惧记忆消退【2, 3】，因此研究者将携带RADICAL的慢病毒表达于小鼠IL神经元。脑片电生理显示，灌流CHXOL可使表达RADICAL的神经元产生膜去极化从而使静息膜电位 （RMP） 升高。在体实验中，利用小鼠恐惧记忆消退模型评价RADICAL的效应。在小鼠的IL表达RADICAL或对照病毒后注射CHXOL，结果显示CHXOL可诱导表达RADICAL的小鼠恐惧记忆消退增加；而在表达对照病毒的小鼠中，注射CHXOL则不影响其恐惧记忆消退。
此外，VTA星型胶质细胞的胞内钙离子浓度升高会增加小鼠的自发活动【4】。由于RADICAL具有钙离子高通透性，因此研究者也在小鼠VTA星型胶质细胞表达了携带TRPM8-I846F-I985K突变的慢病毒，在注射CHXOL后，小鼠的自发活动显著增加。
因此，研究者开发了一个理性设计的配体激活的离子通道 （RADICAL， RAtionally Designed Ion Channel Activated by Ligand） 系统作为化学遗传学工具，通过操纵神经元活动影响动物行为。神经元胞内钙离子水平的升高会影响小鼠的学习、记忆等行为，而RADICAL是基于钙离子通透的TRPM8 I846F-I985K突变体通道，因而此工具也可以应用于研究小鼠学习记忆等行为学。而且TRPM8在脑中的内源性表达有限，因而在中枢神经系统中过表达RADICAL可以在很大程度上避免与内源性野生型TRPM8通道产生异源组装，使得RADICAL成为有潜力的化学遗传学工具。
浙江大学基础医学院生物物理学系博士研究生张恒和浙江大学脑科学和脑医学院学院的博士研究生郑志薇为该工作的共同第一作者。浙江大学基础医学院生物物理学系的杨帆长聘副教授和浙江大学脑科学和脑医学院学院的崔一卉研究员为本文的共同通讯作者。
https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwae048/7748254
制版人：十一
参考文献
1. Xu, L., et al., Molecular mechanisms underlying menthol binding and activation of TRPM8 ion channel.Nat Commun, 2020. 11(1): p. 3790.
2. Duvarci, S. and D. Pare, Amygdala microcircuits controlling learned fear.Neuron, 2014. 82(5): p. 966-80.
3. Orsini, C.A. and S. Maren, Neural and cellular mechanisms of fear and extinction memory formation.Neurosci Biobehav Rev, 2012. 36(7): p. 1773-802.
4. Requie, L.M., et al., Astrocytes mediate long-lasting synaptic regulation of ventral tegmental area dopamine neurons.Nat Neurosci, 2022. 25(12): p. 1639-1650.
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