一文读懂CAR-NK疗法|介导|免疫|细胞治疗|细胞系|肿瘤细胞

前言

近几年，自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）成为下一个被基因工程改造的对象。NK细胞是一种天然免疫细胞，具有与T细胞完全不同的靶细胞识别方式，能泛特异性识别并杀死瘤细胞。外周血中大约90% NK细胞为CD16+CD56dim亚群，表面表达杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer-cell immunoglobulin-like receptor，KIR）和CD57，这群细胞通过产生穿孔素、颗粒酶和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC）发挥细胞毒作用；而占约10%的CD16-CD56bright亚群通过分泌细胞因子发挥免疫调节功能，其大部分聚集在二级淋巴组织，如扁桃体和淋巴结中。NK细胞对肿瘤、病毒、寄生菌和机体老化变异细胞都具极强杀伤和清除能力，在清除瘤细胞方面，NK细胞通过内识别方式直接识别恶变瘤细胞并被激活，对肿瘤有很好杀伤作用。

在NK细胞上通过基因工程表达CAR之后，能增强NK细胞杀伤靶向性，达到治疗肿瘤的效果。为避免免疫排斥反应，CAR-T疗法使用的T细胞常来源于患者本身。由于NK细胞不表达TCR，不会导致TCR介导的排斥反应，因此，CAR-NK疗法优势在于同种异体的CAR-NK细胞不会引起移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD），且几乎不会引发严重不良反应，其安全性更高。

一

CAR-NK疗法原理

NK细胞是从骨髓中分化和发育而来的淋巴细胞，表面表达CD56分子，具天然肿瘤杀伤能力（属固有免疫细胞）。NK细胞表面表达KIR，是NK细胞识别肿瘤细胞的关键受体。在KIR家族蛋白中既有抑制性受体也有激活性受体，当NK细胞遇到正常细胞时，正常细胞表面MHC Ⅰ类分子结合抑制性KIR，阻止NK细胞激活。肿瘤细胞为躲避T细胞攻击会下调表面MHC Ⅰ类分子，此时，NK细胞会因此被激活而杀伤肿瘤细胞。CAR-NK疗法是给NK细胞装上CAR分子提高NK细胞靶向性，使其更快精准杀伤瘤细胞。目前开展的临床前实验显示，CAR-NK细胞在多种肿瘤中展现较好疗效。

二

CAR-NK疗法优势和局限性

CAR-NK疗法最大优势是临床安全性，CAR-NK细胞几乎不会引起细胞因子风暴或神经毒性等毒副作用。其次，同种异体CAR-NK细胞不会引起GVHD，因此CAR-NK细胞来源比其他细胞疗法更多样化。与其他细胞过继免疫治疗相似，CAR-NK疗法也面临在体内受肿瘤微环境影响导致功能障碍的困境。另外，NK细胞在患者体内存活差，不能分化为记忆细胞，因此需输入大量CAR-NK或多次回输产生疗效。所以，如何大量、高效、低成本制备CAR-NK细胞是现在面临的一个挑战。

三

NK细胞的制备流程和质控要点

早期由于NK细胞扩增技术发展陷入瓶颈，NK细胞临床应用受很大局限，少数临床研究抽取患者大量外周血PBMC进行提取后磁珠分选，再进一步培养，扩增效率低、患者负担重、临床疗效差。近年，随着对NK细胞研究的进一步深入，NK细胞扩增方法得到极大发展，细胞来源包括骨髓、外周血、脐带血、多能干细胞和NK细胞系等多种渠道。目前国际上主流临床研究应用包括滋养细胞扩增的NK细胞、NK-92细胞系、细胞因子鸡尾酒扩增的NK细胞和CAR-NK细胞。

（一）滋养细胞扩增NK细胞

对辐照后的瘤细胞、异体PBMCs以及淋巴细胞衍生物进行基因编辑成为滋养细胞，可显著提高NK细胞扩增效率。

缺乏HLA抗原表达的K562细胞是基因编辑最常用瘤细胞系，通过基因工程方法将使其表达NK扩增所需细胞因子和共刺激因子，如膜结合蛋白IL-15，IL-21和4-1BB配体，新的对NK细胞激活和扩张协同刺激因子仍在不断探索。OX40受体刺激增加NK细胞IFN-γ产生、细胞毒性和增殖能力。

人前列腺癌细胞系衍生物PC3PSCA也被基因修饰用来作为滋养细胞，除了表面标记前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）外，还分别表达抑制KIR2DL1和KIR2DL2/3的C1和C2配体，抑制KIR3DL1和抑制NKG2A的HLA-E配体和未知受体的Bw6配体，通过慢病毒转染共刺激膜结合蛋白IL-15、4-1BBL和IL-2的基因序列形成人工NK细胞滋养细胞。

此外，Jurkat T淋巴母细胞亚系KL-1作为滋养细胞也可使NK细胞增殖约100倍，纯度接近90%，同时可相互抑制T细胞生长。通过滋养细胞扩增的NK细胞方法的优点是扩增效率高，NK细胞纯度一般在95%以上，缺点是在培养过程中使用危险性较高的瘤细胞系，可能存在一些远期风险或目前检测技术无法检测的病原学风险。

培养流程为：配置含有10 U/mL硫酸庆大霉素和1000 U/mL白介素2的无血清培养基。分离新鲜人外周血PBMC，计数后用配置的无血清培养基调整PBMC密度为1×106个/mL。加入辐照后滋养细胞和5%~10%的自体血清，置于37℃、5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，以后每2 d换液1次。分别通过锥虫蓝染色和流式细胞术检测NK细胞数量、活率和表型，通过杀伤实验确定NK细胞的杀伤功能。通过细菌、真菌、支原体、内毒素检测确定所培养细胞的安全性。

（二）NK-92细胞系

NK细胞系是1992年从一名确诊为非霍奇金淋巴瘤的50岁患者外周血中分离而出，由Hans Klingemann在加拿大温哥华的Terry Fox实验室建立的肿瘤细胞系，在IL-2的支持下可长期存在。在缺乏IL-2条件下NK-92细胞系细胞毒性在24 h后下降，在72 h内细胞死亡。

NK-92细胞表面阳性标志为CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54、CD56bright，阴性标志为CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34、HLA-DR。在100 U/mL的IL-2浓度下，约50%的细胞表达CD25（p55 IL-2受体），其表达与IL-2浓度呈负相关。NK-92细胞系表达相对大量的活化受体（NKp30、NKp46、NKG2D、CD28）。相反，它表达少量的抑制受体（NKGA/B，低水平的KIR2DL4，ILT-2），缺乏表达在正常NK细胞上大多数克隆的杀手抑制受体KIRs。此外，NK-92表达高水平参与穿孔素颗粒酶细胞溶解途径的分子，以及附加细胞毒性效应分子，包括肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员FasL，TRAIL，TWEAK，TNF-α，表明其有很强肿瘤杀伤功能和免疫调节功能。

除NK-92细胞系外，NK肿瘤细胞系还包括KHYG-1细胞系，NK-YS细胞系，SNK-6细胞系和MC-1细胞系，均是从NK细胞淋巴瘤患者外周血中分离而建立，所有NK细胞系都有一个共同点就是表面标志物CD16分子表达非常低，缺乏大多数经典细胞毒性NK细胞所具有的ADCC效应。

在所有NK永生化细胞系中，NK-92是唯一经FDA批准可用于临床试验的细胞系。需要特别注意的是，NK-92细胞在输入人体前须行辐照处理，防止NK-92的体内增殖，同时保障其杀死靶细胞和产生免疫活性细胞因子的能力。NK细胞系的优点在于细胞质量均质化较好、来源有保障、容易产业化，缺点在于远期潜在肿瘤风险。

（三）细胞因子鸡尾酒扩增的NK细胞

在无滋养细胞情况下，细胞因子是体外维持NK细胞存活和体外扩增的关键，许多研究通过多种细胞因子组合法建立了NK细胞扩增体系。IL-2是维持NK细胞增殖和细胞毒性的必要细胞因子，同时也能刺激T细胞增殖。因此通过纯细胞因子体系扩增的NK细胞主要有两种途径，一种是将外周血中PBMCs分离后去掉CD3+T细胞，剩余细胞再进行培养，这种方法获得的NK细胞纯度高，但操作更为复杂；另一种是不去除T细胞直接培养，这种方法简便易行，缺点是NK细胞纯度较低。

单独使用IL-15、IL-2或IL-21等细胞因子时，NK细胞增殖效率较低。在T细胞去除培养体系中，单用IL-15培养9 d扩增约2.5倍，IL-15联合IL-21培养10~12 d扩增约7.5倍，IL-15、IL-18联合IL-21培养21 d约扩增17倍。IL-2联合IL-15培养12 d可扩增30倍以上，以上体系培养的细胞终产品中NK细胞纯度均在90%以上。细胞因子鸡尾酒扩增NK细胞具有很好安全性，不会有瘤细胞系扩增相关风险，但扩增效率较低。

（四）CAR-NK细胞

对NK细胞进行基因修饰是目前非常热门的免疫治疗方法，多用于治疗对传统疗法无效的晚期肿瘤患者。CAR受体可赋予NK细胞与表达目标抗原的细胞高度亲和力，从而降低细胞激活和效应功能诱导的阈值。CAR-NK细胞由于其非MHC限制性，不会引起GVHD，来源广泛可迅速用于治疗患者。此外，在给予CAR-T细胞患者中观察到CRS或神经毒性等不良反应，而临床试验中使用CAR-NK细胞过继疗法无CRS、神经毒性或GVHD发生，包括IL-6在内炎症细胞因子水平未见增加。

目前，基于CAR-NK的目标受体包括NKG2D、HER2、CD19、CD20、CD7、CD3等。NK细胞表达的活化受体包括NCRs、DNAM-1等独立于CAR体系，又能与CAR系统相互协同，使原有肿瘤逃逸机制失效。此外，由CD16介导的NK细胞ADCC效应是一种额外肿瘤杀伤策略。CAR-NK构建可不局限于患者自体细胞，可使用脐带血细胞、诱导型多能干细胞，甚至使用永生化NK细胞系（NK-92）作为细胞来源。

（五）NK细胞质量控制

NK细胞作为一种直接输入人体的细胞产品，其质控必须考虑传染病、免疫排斥、外来污染等风险。NK细胞应用主要包括采集、运输、制备、检测、储存及回输等一系列过程。储存机构需要建立完善的检测机制以避免污染等风险，保障供者、受者及过程中可能涉及的采集、制备等相关人员健康安全，及时发现不合格情况，以便于采取措施，避免不良事件发生。具体包括以下几点：

（1）对终产品细胞制剂，应注明来源并加以标记或确定批号。

（2）培养的NK细胞终产品，细胞数量应满足临床最低需求，存活率应不低于90%。

（3）细胞的纯度与均一性：细胞回输前，应证明纯度和均一性达临床应用水平。

（4）每批培养细胞在输注前均应进行无菌实验。建议在培养开始后3～4 d起每间隔一定时间取培养液样品，包括患者输注前48 h取样，按《中国药典》（2020年版）生物制品无菌实验规程进行。患者使用前，取培养液及/或沉淀物用丫啶橙染色或革兰染色，追加一次污染物检测。

（5）每一批体细胞终制剂应留样检测支原体。如留样发现阳性结果或发现几次阳性结果后，应及时对生产过程进行检查。如在细胞制备早期发现有污染，应终止该批细胞制品继续制备。

（6）NK细胞制备终产品生物学功能：包括NK细胞杀伤功能，分泌细胞因子的能力，表达某种标志的水平等。

a.细胞表面标志物：CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD19、CD56等，这些标志物可以基本确定制备种产品免疫细胞组分和NK细胞的纯度。

b.杀伤靶细胞功能活性标志：颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素等，它们能介导效应细胞对靶细胞进行溶解杀伤作用。

c.免疫功能相关标志：IFN-γ，TNF-α，IL-2等可调节机体免疫系统反应性间接杀伤靶细胞。

（六）NK细胞制备及输注过程资料档案

从事体细胞制剂机构应具有自体免疫细胞制备及检定过程的原始记录和检定报告，永久保留。

四

NK细胞在血液肿瘤中的应用

（一）NK细胞在造血细胞移植中的应用

HLA匹配的异体造血细胞移植（hemopoietic cell transplantation，HCT）技术彻底改变了血液肿瘤患者的治疗，仍是大多数危重患者唯一治愈疗法。然而完全符合HLA供体给HCT带来障碍，目前临床上广泛使用HLA单倍相同（半匹配）或部分匹配的脐带血移植物，移植引起的排异反应和疾病复发仍是治疗失败主要原因。因此，需要安全、特异和有效的细胞疗法来缓解这些限制，或对某些肿瘤患者完全替代HCT。2002年，Ruggeri等发现半相合NK细胞能有效促进造血干细胞清除瘤细胞，降低复发率。几年后，对非清髓性化疗后未进行HCT的19例AML患者输注半相合NK细胞，有5例出现供体NK细胞扩增和诱导完全血液学缓解，表明半相合NK细胞可在患者体内存活和增殖，并可单独使用或作为HCT辅助治疗手段。

供体NK细胞介导同种异体反应可通过移植物抗白血病（graft versus leukemia，GVL）效应杀死瘤细胞，通过消融受体T细胞促进移植，并通过消耗受体抗原提呈细胞和产生IL-10来预防GVHD。在HCT中，供者NK细胞基因型是预测异源受者生存期和是否复发的一个强有力的独立因素。在一项针对112例高风险急性髓系白血病患者HCT研究中，接受同种异体NK细胞（n=51）患者由于供体NK细胞受体中缺失HLA-Ⅰ类杀伤细胞免疫球蛋白样受体配体，移植后患者复发率显著降低相关（3% vs 47%），复发期患者移植后无事件生存期（34% vs 6%，P=0.04）和缓解期移植患者无事件生存期（67% vs 18%）更长，复发或死亡风险降低。一项Ⅰ期临床研究在HCT后2周和3周给予IL-15联合IL-21扩增的NK细胞，与历史上接受相同条件治疗方案但未输注NK细胞的HCT患者相比，白血病进展有所减缓（风险比0.527，P=0.042）。另一项Ⅰ期研究表明，多次的K562-IL21-41BBL扩增体系培养的NK细胞治疗（HCT后第2 d、7 d和28 d）可有效控制白血病复发。NK细胞在HCT前输注安全可行，NK细胞转移也可作为转入HCT的桥梁，有助于减轻疾病负担，使患者符合HCT条件。此外，HCT后NK细胞快速恢复与预后改善相关，NK功能受损可能是复发原因。

（二）NK细胞在非造血细胞移植中的应用

由于HCT局限性使其不能适用于所有患者，NK细胞也可在血液肿瘤中单独使用。在19例预后较差的AML患者中，同种异体NK细胞联合高剂量环磷酰胺和氟达拉滨治疗后，患者内源性IL-15显著升高，供体NK细胞大幅度扩增，并诱导完全的血液学缓解。随着对KIR错配机制进一步研究，过继NK细胞回输成为AML治疗的一种行之有效的策略，不仅可诱导患者肿瘤病情缓解，还可较长时间维持在缓解状态。13例接受2.74×106/kg体重NK182细胞的AML中，6例患者完全缓解，其中3例分别在34个月、32个月和18个月后痊愈。另一项研究16例患者接受氟达拉滨/环磷酰胺联合全淋巴照射治疗，然后IL-2激活同种异体NK细胞过继免疫治疗，6例患者达到客观缓解。伴随NK细胞扩增技术发展，大剂量同种异体NK细胞输注在临床上得到应用，应用5×106/kg体重NK细胞治疗的17名AML患者中，中位随访时间为22.5个月，有9例无病存活，7例复发，中位复发时间为9个月。所有接受治疗患者都达到分子水平完全缓解，输注更多同种异体NK细胞可延长无病生存期。此外，同种异体NK细胞过继回输联合化疗有助于AML患者进一步缓解，微小残留病灶减少，长期复发率降低。

IL-2虽具刺激NK细胞作用，但同时刺激宿主Treg细胞，可抑制NK细胞在体内的增殖和扩张。Miller等通过NK细胞回输前1~2 d给予患者IL-2白喉毒素（IL-2DT）方法，清除患者Treg细胞，改善了CR率（53% vs 21%）和无病生存率（33% vs 5%），使用IL-2DT或低剂量照射也会增加NK 细胞在骨髓中归巢和持久性，更好控制白血病。

（三）CAR-NK细胞在血液肿瘤中的应用

目前临床应用CAR-NK细胞进行治疗研究较少，在一项Ⅰ/Ⅱ期临床研究中，11名患者CLL患者接受抗CD19 CAR-NK细胞治疗，其中8名患者（73%）有临床应答。这些患者中7例（4例淋巴瘤，3例慢性淋巴瘤）完全缓解。在注射CAR-NK细胞后30 d内，迅速出现控瘤反应，回输后CAR-NK细胞在患者体内低水平持续存在至少12个月。另一项研究用CD28和4-1BB共刺激结构域靶向CD33的第三代CAR转导NK-92细胞系，治疗3例复发或难治性AML患者，当输注NK细胞剂量达到5×109个细胞时，未见明显不良反应。

五

NK细胞在实体肿瘤中的应用

一项为期11年的随访研究表明，人体NK细胞毒性低将增加罹患肿瘤的风险。随着抑制性KIRs的发现及其在防止NK细胞杀死自我MHC-Ⅰ类分子表达的瘤细胞中发挥作用，学界开始研究使用同种异体供体NK细胞代替自体NK细胞用于实体瘤治疗的可能性。

（一）常规培养NK细胞的临床应用

同种异体NK细胞联合化疗+抗GD2单抗在13例儿童复发/难治性神经母细胞瘤临床研究中，11例接受29次同种异体NK细胞治疗，有效率为61.5%（完全缓解4例，部分良好缓解1例，部分缓解3例），5例病情稳定；中位进展时间为274 d（范围239~568 d）；13例患者有10例（77%）存活1年。另一项难治性神经母细胞瘤Ⅰ期临床试验中，35名患者接受从1×106到50×106/kg体重5个剂量水平NK细胞治疗，10例（29%）完全或部分缓解，17人（47%）无反应，8人（23%）病情进展。这些研究表明同种异体NK细胞治疗联合抗GD2单抗的安全性强，NK细胞在较高剂量下具更好抗神经母细胞瘤活性，具有很好临床应用潜能，但仍需进一步证实。

同种异体NK细胞治疗复发性卵巢癌和乳腺癌的Ⅱ期研究中，14例卵巢癌患者和6例乳腺癌患者接受平均剂量为2.16×107/kg体重的NK 细胞治疗。其中9/13例（69%）未经全身放疗患者和6/7例（85%）经过全身放疗患者在回输NK细胞后7 d检测到供体DNA，1例在体内成功进行供体NK细胞扩增。一项针对8例高危复发多发性骨髓瘤患者研究中，将通过K562-41BBL-IL15滋养细胞扩增的NK细胞以1×10⁸/kg体重的剂量输注给患者，随后每日给药IL-2，其中5例中观察到明显NK细胞体内增殖，在第7 d或近7 d达峰值，供体NK细胞占受体循环NK细胞的90%，未发生NK细胞治疗相关的严重不良事件。1例患者部分应答，1例疾病进展速度减慢，5例病情进展不受NK细胞治疗影响，证实大剂量NK细胞治疗安全性，初步表明NK细胞在患者体内是否增殖是临床预后的关键因素。

（二）基于NK瘤细胞系的临床应用

基于NK-92细胞系易于培养和扩增的特性，一些研究者也将其应用于临床治疗难治性和耐药的肿瘤，在剂量递增实验中，7例患者接受1×109/m2体表面积、6例患者接受3×109/m2体表面积、2例患者接受10×109/m2体表面积的NK-92细胞治疗，所有患者对回输剂量耐受，未见严重不良反应，3名晚期肺癌耐药患者出现控瘤应答，清除肿瘤转移灶。另一项应用NK-92细胞系治疗难治性转移性肾细胞癌的Ⅰ期临床研究中，12例患者1例发生3级发热和1例发生4级低血糖，所有不良反应均为一过性反应，未经治疗自动恢复，1例在NK-92回输后4年仍存活。

（三）CAR-NK在实体瘤中的临床应用

在CAR-NK细胞治疗实体瘤临床研究中，将NK细胞受体NKG2D胞外结构域与DAP12融合，采用RNA电穿孔的方法构建CAR来改善NK细胞肿瘤反应，降低了临床应用风险。NKG2D-CAR-NK表达显著增强了NK细胞在体外对几种实体瘤细胞系细胞溶解活性，并对已建立实体瘤的小鼠提供明显治疗效益。3例转移性结直肠癌患者接受CAR-NK细胞局部输注治疗，2例腹腔输注低剂量CAR-NK细胞患者，腹水产生减少，腹水样本中肿瘤细胞数量显著减少；另1例患者在肝转移瘤部位接受超声引导下经皮注射，然后腹腔内灌注CAR-NK细胞，多普勒超声成像观察到肝脏区域肿瘤迅速消退，PET-CT证实治疗后肝脏病变完全代谢应答。该研究结果强调使用RNA CAR-NK细胞治疗转移性结直肠癌良好治疗潜力。

在NK细胞治疗实体瘤的临床研究中，NK细胞治疗具有良好安全性，初步结果发现治疗效果可能与细胞剂量有关，目前在临床上应用包括难治性和转移性肺癌、肝癌、肾癌、结直肠癌。需开展均质化较高前瞻性随机对照临床研究来进一步确定对患者临床症状、免疫状态、生存质量和生存期的影响。

《中国肿瘤整合诊治技术指南(CACA)

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