【第四届检验与临床（血液与体液）思维案例大赛总决赛稿件】
作者 | 庄子溦1 林睿敏2
单位 | 三明市第一医院：1.检验科，2.风湿免疫科
前 言
耶氏肺孢子菌肺炎（pneumocystis jirovecii pneumonia, PJP）是一种发生于免疫功能低下患者的严重肺部机会性感染。随着现代医学技术的发展，如器官移植、肿瘤放化疗及免疫抑制剂的应用等，此类病例的发生有逐渐增多趋势。PJP临床症状不典型且进展迅速，病死率较高[1] 。治疗PJP成功的关键是早发现、早治疗。对于这类患者，寻求安全高效的非HIV-PJP诊断方法及个体化治疗方式尤为必要。
肺隐球菌病（Pulmonary cryptococcosis，PC）是由新生隐球菌感染引起的一种亚急性或慢性肺部真菌病。隐球菌为条件致病菌，多发生于免疫低下的人群中。近年来发现免疫功能正常的肺隐球菌病患病率逐年升高，肺隐球菌病的临床表现无特异性，CT 影像学又表现为多样性，容易误诊为肺结核、肿瘤、肺炎等其他疾病。
我们在临床工作中遇到了一例系统性红斑狼疮患者，肺部耶氏肺孢子菌合并隐球菌感染。患者以“发热”入院，免疫功能低下，通过特殊染色镜检和二代测序等技术手段并驾齐驱明确了致病菌，并及时有效的制定抗感染方案控制住了肺部感染。实验室与临床的群策群力让患者取得了理想的治疗效果，现将我院病例分享如下。
案例经过
患者，女，15岁，主诉“发热10天”。10天前无明显诱因出现发热，偶有咳嗽，咳少许白痰，不易咳出。入院前一天再次出现发热体温最高达39.0℃，伴畏冷，发热时伴全身酸痛，无寒战，自行予“布洛芬”治疗，体温较前下降，今为进一步治疗，复诊我院，查体：T 36.9℃，P 125次/分，R 20次/分，BP 103/75mmHg。双肺呼吸音稍粗，未闻及明显干湿性啰音。既往史6月前就诊我院查完善相关检查后诊断为“系统性红斑狼疮性肾炎”，规律使用“甲泼尼龙、吗替麦考酚酯、他克莫司”等治疗。
实验室检查结果如表1。
表1
2023-07-31 双肺CT平扫(图1)：双肺弥漫性磨玻璃影，出血与炎症不能区分。
图1
2023-08-01 患者其他辅助检查结果：血液真菌(1,3)-β-D-葡聚糖（G试验）1031.42(阳性)pg/mL，曲霉菌半乳甘露聚糖（GM试验）0.08（阴性），血清隐球菌荚膜多糖抗原（CrAg）阴性。双肺广泛磨玻璃改变。
因患者G试验结果>600 pg/mL，提示该患者存在真菌侵袭性感染。患者长期使用免疫抑制剂及糖皮质激素治疗，抵抗力低下，属于PJP高危人群。考虑其PJP感染可能性大，实验室对肺泡灌洗液行常规细菌培养和涂片检查，并给涂片加做了六胺银染色，并将检验结果及时反馈给临床。
微生物室在六胺银染色涂片中看到肺孢子菌菌体（图2），圆形酵母样真菌菌体，部分菌体有荚膜，同时还发现了泰坦细胞（图3）。在革兰染色涂片中，见到似隐球菌菌体有荚膜（图4）,加做肺泡灌洗液隐球菌荚膜多糖抗原结果为阳性。
临床根据我们涂片结果使用了复方磺胺甲噁唑960mg q6h联合氟康唑0.4g ivgtt qd抗感染治疗。
图2 六胺银涂片染色
图3 泰坦细胞
隐球菌在感染过程中可形成异常增大的细胞，胞体直径大于15 µm或总尺寸（包括荚膜）超过 30 µm。因体积巨大，很难被吞噬，可在机体内长期存活，泰坦细胞是其适应宿主，逃避人体免疫反应的机制之一。
图4 Balf革兰染色
2023-08-04 肺泡灌洗液NGS回报（图5）：耶氏肺孢子菌 序列数200932，新生隐球菌复合群序列数4239，人疱疹病毒5型，序列数 10059，NGS见人疱疹病毒序列数升高，考虑合并巨细胞病毒感染，加用更昔洛韦抗病毒治疗。
图5 肺泡灌洗液宏基因组mNGS报告病原体结果
2023-08-04 肺泡灌洗液常规细菌培养出湿润粘液状菌落（图6），经梅里埃MALDI-TOF质谱仪鉴定为新生隐球菌（图7）。
图6 患者肺泡灌洗液培养结果
图7 新生隐球菌的质谱鉴定图谱
2023-08-07患者“肺部感染（耶氏肺孢子菌+新生隐球菌）”诊断明确。患者有头晕、头痛不适，因新生隐球菌极易通过血流播散性传播至中枢神经，需注意排除脑部隐球菌感染，头颅CT未见占位，行腰椎穿刺术，送检脑脊液相关检查。脑脊液常规提示WBC：1.0*10^6/L、隐球菌荚膜抗原、涂片找抗酸杆菌、涂片找新生隐球菌、脑脊液培养均为阴性结果，可以排除颅内感染。
2023-08-17经治疗，该患者的感染指标CRP，IL-6，降钙素原持续下降，G试验结果也降至272.29pg/mL，复查肺部CT示炎症明显吸收，抗感染治疗有效，考虑其为慢性病，予办理出院，外带药物巩固治疗，嘱规则抗真菌治疗，切勿擅自停药，定期复查双肺CT（图8）。
A.2023-07-31 肺部CT：两肺多发片状，密度增高影，边界模糊
B.2023-08-07 肺部CT：双肺渗出病灶，较前吸收
C.2023-08-17 肺部CT：双肺渗出病灶，现较前基本吸收，右肺数个结节影。
图8 复查双肺CT
表2 患者病程中G试验、白介素6等指标的动态变化
临床案例分析
患者确诊系统性红斑狼疮6月，长期规则服用免疫抑制剂及糖皮质激素治疗，机体免疫功能低下，感染风险高。此次以“发热、咳嗽”症状为主要表现起病急，病程短，入院后急查肺部CT显示为弥漫性磨玻璃样改变，初步考虑肺部感染（肺孢子菌可能）。
该患者初诊系统性红斑狼疮时以浮肿、蛋白尿等狼疮性肾炎表现为主，平素律用药及随访病情控制尚可，复查抗DsDNA、尿蛋白均较前下降，补体上升，ANA阴性，提示病情趋稳，结合其临床症状及其他辅助检查，我们考虑此次发热、咳嗽与系统性红斑狼疮、狼疮性肺炎相关可能性小。
考虑患者有规则较大剂量甲泼尼龙及免疫抑制药物的使用，结合急查肺部影像学结果，经完善肺泡灌洗液涂片、NGS等病原学检查，明确为肺部感染（肺孢子菌+新生隐球菌），予复方磺胺甲噁唑960mg q6h联合氟康唑0.4g ivgtt qd抗感染治疗后，患者恢复良好，半月后复查肺部CT提示炎症明显吸收。
大多数肺孢子菌感染患者以少痰、干咳起病，体温正常或发热，之后出现胸痛、呼吸困难，很快出现呼吸窘迫，未及时发现的患者病死率可高达90-100%。当具有基础疾病，且有 PJP发展 的高危因素，高度怀疑而暂时不能确诊时，可提前预防用药经验性治疗，降低病死率。
检验案例分析
肺隐球菌病的影像学表现无特异性，但一般多表现为肺部结节，因此常被误诊。在国内，隐球菌在所有侵袭性真菌疾病中排名第三，仅次于曲霉和念珠菌。血清隐球菌荚膜多糖抗原（CrAg）检测有很好的特异度，有助于筛查疑似肺隐球菌病的患者，但存在有一些局限性。
有文献报道，血清 CrAg 检测灵敏度为65.35%，考虑存在一定的假阴性率。本案例患者血清CrAg为阴性，肺泡灌洗液CrAg为阳性。在肺泡灌洗液涂片检出泰坦细胞和疑似隐球菌菌体，经培养后鉴定为新生隐球菌，更加说明了传统的涂片镜检和微生物培养技术在感染性疾病的病原学诊断中，仍然是非常基础且重要的检验方法。
非HIV感染的PJP患者体内肺孢子菌的负荷量较少，临床诊断率较低。而PJP感染时可出现症状和体征不符合，也就是症状重、体征轻。临床及时与实验室的沟通，实验室在接收到的肺泡灌洗液标本时，加做六胺银染色涂片发现肺孢子菌，给予临床强有力的循证依据。
值得关注的是，PJP曾难以获得病原学诊断但由于mNGS的推广应用，呼吸道标本重成功检出肺孢子菌大大提升，另外还可以同时辨别多元病原体。这对于混合感染的诊断具有重要意义。然而，mNGS容易受到人源核酸，环境微生物干扰。阳性结果仅代表临床标本中检出某病原体的核酸片段，无法确定该病原体与感染之间的关系，在条件允许的下，还需应用其他方法或者感染相关的标志物进行相互验证。
知识拓展
01
隐球菌肺病
隐球菌病是由隐球菌引起的深部真菌感染，主要侵犯中枢神经系统及肺部，常发生于免疫功能低下的患者，免疫功能正常的人群也有发生，肺部隐球菌感染临床与影像表现多样，缺乏特异性，容易误诊。
实验室检测隐球菌的方法包括显微镜镜检、隐球菌荚膜多糖抗原、mNGS和分离培养等。显微镜镜检阳性率低，荚膜多糖抗原某些因素可能为假阳性。分离培养虽为检测隐球菌的金标准，但隐球菌生长缓慢，易漏检需延长培养时间。
将以上试验方法联合应用，通过联合检测，能够有效提高检测结果的敏感度和特异度，对提高临床感染的病原学诊断准确性有很大帮助。
02
肺孢子菌
耶氏肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii pneumonia, PJP）是由耶氏肺孢子菌 （Pneumocystis jirovecii, PJ）感染导致的急性或亚急性肺炎，是自身免疫性疾病患者常见的机会性感染之一。使用糖皮质激素是 PJP 最重要的危险因素，其他危险因素还包括免疫抑制药物的使用、血液系统、实体癌症、器官移植、免疫系统疾病等[2]。
系统性红斑狼疮 （systemic lupus erythematosus, SLE）患者由于长期使用激素以及免疫抑制剂，可导致患者免疫功能降低，增加感染的机会。PJ不能培养，目前主要通过显微镜检查形态学诊断，或采用分子生物学检测方法来帮助诊断。
对于PJP，(1,3)-β-D-葡聚糖是一项很好的辅助标志物，PJ感染时明显升高。（1,3）-β-D-葡聚糖是 PJ 细胞壁的一个组成部分，在排除其他侵袭性真菌（曲霉和念珠菌感染）感染的情况下，2次或2次以上血清G试验≥80pg/mL，可以考虑PJP；虽然G试验对 PJ没有特异性，但在感染患者中的水平高于定植的，也有助于诊断。
国外文献报道，联合G试验及LDH诊断PJP,若G试验结果达到400pg/mL和LDH达到350U/L时，敏感度达92.8%,特异度达83.9%。PCP 的病死率极高，未经治疗的 PCP 患者死亡率几乎100% ，经过治疗仍有 5%～50% 的死亡率。PJP已成为临床上的不可忽视的病症，PJP的早期诊断是治疗成功的关键。
案例总结
免疫力低下人群感染隐球菌、肺孢子菌的风险大大增加，但合并感染较为少见。有报道强的松和免疫抑制药物的使用已被确定为感染发展的强预测因素[3]。本案例患者为系统性红斑狼疮性肾炎患者，免疫功能低下，感染风险增加，临床诊治此类患者感染时需考虑条件致病菌和少见菌。
有国外文献报道，联合G试验及LDH诊断PJP,若G试验结果达到400pg/mL和LDH达到350U/L时，敏感度达92.8%,特异度达83.9%[4]。由于G具有较强的阴性预测值，可用于排除 PJP。
在诊疗中，临床医生积极完善相关检验和检查，并请多学科会诊，保持与微生物室的密切沟通，微生物室帮助患者检出病原菌。及时有效开始应用抗感染措施，帮助患者早日治愈和良好的预后发挥了重要的作用。
通过此次案例可以发现临床和检验工作密不可分，在对病原菌的认知水平方面，应该互通有无，齐头并进。想临床之所想，急患者之所“疾”，临床检验融合发展，为患者制定最佳的抗感染方案，争取早发现早治疗为广大患者减轻痛苦缩短病程。
专家点评
三明市第一医院检验科 主任技师 李小霞
本例中，患者确诊系统性红斑狼疮6月，长期服用免疫抑制剂和激素，导致机体免疫功能低下，患者的感染风险显著增加。该患者入院检测白蛋白跟CD4+T淋巴细胞较低，炎症指标升高，CT显示双肺弥漫性磨玻璃影和较高的G试验结果，这些检查对于肺孢子菌感染是一个很好的辅助诊断标志，临床可高度怀疑肺孢子菌的感染，通过肺泡灌洗液的特殊染色涂片检查及mNGS分子测序技术，两项技术相辅相成，证时了PJP跟肺新生隐球菌病的诊断。
近年来，临床病原体组成日趋复杂，抗感染治疗面临更大的挑战。在此情况下，临床医生及时与微生物室保持密切沟通，同时多学科同心协力为患者制定更为恰当的抗感染治疗方案，有效控制感染更好地保证患者生存及生活质量。
参考文献
[1] Yale SH, Limper AH. Pneumocystis carinii pneumonia in patients without acquired immunodeficiency syndrome: associated illness and prior corticosteroid therapy)[J]. Mayo Clin Proc, 1996, 71:5-13.
[2] Rous A, Gonzalez F, Roux M, et al. Update on pulmonary Pneumocystis jirovecii infections in non-HIV patients[J]. Med Mal Infect, 2014, 44(5): 185-198
[3] 余金泉,徐冰凌,陈冬莹,等.血清降钙素原在系统性自身免疫病患者细菌感染的诊断价值[J].中华医院感染学杂志, 2015, 25(24):3.DOI:10.11816/cn.ni.2015-144850.
[4] Seringa,M,Matos,et al.(1-3)-Beta-D-glucan in association with lactate dehydrogenase as biomarkers of Pneumocystis pneumonia (PcP) in HIV-infected patients[J].European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology, 2014.
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编辑：徐少卿 审校：陈雪礼
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