牛蛙病害高发如何应对？陈昌福：可利用牛蛙免疫系统特点实施免疫预防|免疫系统|免疫预防|淋巴细胞|特异性|美国牛蛙|陈昌福

文/华中农业大学陈昌福，武汉科研时代生物技术有限公司周鑫军

正文/6228字

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在牛蛙养殖过程中，由于各种传染性疾病高发，已经各地的牛蛙养殖业在成了较大的损失，也成为牛蛙养殖业者遇到的难题。由于牛蛙养殖业者盲目、滥用各种抗微生物药物的结果，致使很多牛蛙养殖场已经难以筛选到可以控制牛蛙传染性疾病的水产用兽药了。

为了探讨利用免疫学技术预防养殖牛蛙各种传染性疾病的可行性，这篇文章在详细介绍牛蛙的免疫系统，及其非特异性和特异性免疫应答状况的基础上，得出了对养殖牛蛙采用免疫学技术预防各种传染性疾病，是完全可行的结论。

从免疫系统特点谈对牛蛙

免疫预防传染性疾病的可行性

摘要：本文在简要陈述牛蛙养殖过程中，容易遭受各种传染性疾病危害，导致牛蛙养殖业者难以采用水产用兽药控制牛蛙疾病的情况下，提出遵循免疫学原理、采用免疫学技术预防养殖牛蛙传染性疾病的设想。随后在基于牛蛙（Rana catesbeiana）免疫系统具有的非特异性和特异性免疫功能的前提下，进行了利用免疫学技术预防养殖牛蛙传染性疾病的可行性分析，获得的结论是利用免疫学技术对养殖牛蛙的传染性疾病，实施免疫预防是可行的。

关键词：牛蛙；免疫系统；免疫预防；传染性疾病；可行性分析

在高密度养殖牛蛙（Rana catesbeiana）的过程中，各种传染性疾病高发，是令牛蛙养殖业者非常头痛的问题。譬如由箭毒蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）引起的真菌性疾病、米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）等引起的细菌性疾病以及由沼泽绿牛蛙虹彩病毒（Rana grylio virus，RGV）等引起的病毒性疾病，都是牛蛙养殖过程中常见的传染性疾病。

为了控制传染性疾病对养殖牛蛙的危害，各地的牛蛙养殖业者主要是依靠大量而频繁地使用各种抗微生物药物，其结果不仅导致了危害养殖牛蛙的致病性生物产生了严重耐药性，甚至牛蛙养殖环境中的各种细菌也产生了极强的耐药性。不少牛蛙养殖场在面对严重危害养殖牛蛙的各种传染性疾病时，已经陷入到了无药可用的境地。

利用免疫学原理，采用免疫学技术预防人类、养殖畜禽以及鱼类的传染性疾病，已经在国内、外获得了众多的成就，而采用免疫学技术预防养殖牛蛙传染性疾病的研究尚不多见。本文仅从牛蛙免疫系统的特点，讨论了采用免疫学技术预防牛蛙传染性疾病的可行性。

一、

牛蛙的免疫系统

牛蛙的分类地位属于两栖纲（Amphibia）、无尾目（Anura）、蛙科（Ranidae）、蛙属（Rana）。牛蛙已经拥有比较完善的非特异性免疫和特异性免疫系统的免疫防御功能。

1 牛蛙的非特异性免疫系统

牛蛙的非特异性免疫系统是在系统发育过程中建立起来的一种防御机能，在牛蛙的生长发育过程中起着极其重要的免疫防御作用。参与牛蛙非特异性免疫的因子，主要是牛蛙体表防御屏障、体液因子，吞噬细胞、红细胞等，这些物质或细胞可以直接分解细菌、真菌，抑制细菌或病毒的复制，或直接吞噬侵入牛蛙机体內的微生物或异物，从而防止机体异常的变化。

1.1 牛蛙的皮肤及其分泌物

牛蛙的皮肤直接与栖息环境相接触，也是外界细菌、病毒等微生物侵入机体的必经门户。作为机体的第一道免疫防御器官，牛蛙的皮肤有很强的屏障作用和抵抗病原入侵的重要功能。牛蛙皮肤外层具有许多皮肤腺，能够分泌出多种具有特殊生理和药理作用的生物活性物质来抵御外来的入侵生物。

皮肤腺的分泌物中常含有神经肽、毒素、激素和抗菌肽等。牛蛙皮肤分泌液中有4大类生物化学成分，即生物胺、蟾蜍配基、生物碱、多肽与蛋白质。皮肤分泌液中的活性物质主要包括蛋白多肽类和小分子有机物。蛋白多肽类主要有小分子多肽、大分子多肽和抗菌肽。很多活性物质具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等功效。其中抗菌肽是参与非特异性免疫的重要物质，在结构上可以简单地分为两大类：一类为线性α-螺旋多肽，不含二硫键；另一类是环性肽，含有分子内二硫键。

已经有研究结果证实，牛蛙的皮肤抗菌肽具有抗菌活性，有抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌的能力。目前，国内外许多学者正在对牛蛙的皮肤分泌物的种类、结构、作用机制、活性功能以及基因表达调控等方面进行深入研究。

1.2 牛蛙呑噬细胞和红细胞

牛蛙的血细胞发生模式与其它高等脊椎动物的模式相类似，也是由多能造血干细胞分化成定向造血干细胞，进而由定向造血干细胞分化、发育成各种血细胞。红骨髓是活跃的造血器官，可制造各种血细胞，而脾也具有造血的功能，但是，不如红骨髓的造血功能活跃，主要是制造巨核细胞系细胞和单核细胞系细胞。

与其他动物一样，牛蛙的白细胞可分为有粒和无粒2类，有粒白细胞又可分嗜中性白细胞，嗜酸性白细胞和嗜碱性白细胞，无粒类白细胞可分单核细胞和淋巴细胞。牛蛙的白细胞一般比爬行类的白细胞要大，淋巴细胞占比例也较高。外周血细胞中，粒细胞占一定的比例，并多呈椭圆形或圆形，具有伪足，有一定的运动、吞噬和吞饮的功能，能阻止病原体通过组织液向机体各部分扩散，从而达到保护机体的目的。当温度降低，淋巴细胞增殖能力下降时，牛蛙体内的粒细胞比例可能明显升高。

牛蛙的成熟红细胞（erythrocyte）多为有核的椭圆形或卵圆形，细胞核位于细胞中央，在血液中可进行有丝分裂和无丝分裂。未成熟的红细胞较成熟红细胞小而圆，核质比较大。

牛蛙的血栓细胞呈纺锤形或长梭形，核染色质很浓密，呈深紫红色。这类细胞功能类似于哺乳动物的血小板。但是，形态和来源却完全不同。

1.3 组织和体液中的抗微生物物质

牛蛙的体内也存在溶菌酶、凝聚素、抗菌肽、干扰素、补体等抗微生物物质，并具有相应的非特异免疫的生物活性与效能。

有人在实验中观测到牛蛙皮肤粘液和腹腔液具有很强的自凝能力，将其取出后即刻便会自行发生凝聚。有人采用泽蛙（Rana limnocharis）、沼蛙（Rana guentheri）、斑腿泛树蛙（Polypedates megacephalus）、黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus）、花细狭口蛙（Kalophrynus pleuurostigma）和花姬蛙（Microhyla pulchra）的血清与红细胞进行种内、种间，及6种供试蛙的红血球与兔血清及植物血凝素（PHA）进行凝集试验，除花细狭口蛙与黑眶蟾蜍以及6种供试蛙的红血球与兔血清及PHA发生凝集外，其余蛙之间不出现凝集。这个实验结果表明凝集反应除可以反映蛙类的亲缘关系外，也表明蛙类血清与红细胞对异物有一定识别和排斥作用。

牛蛙同样存在C-反应蛋白（CRP），CRP是由五个相似的大小约23kDa的亚基以非共价健相连，均衡对称分布。CRP参与对炎症的免疫反应，包括在Ca2+存在下和胆碱磷酸结合起来识别病原生物，诱导嗜菌作用发生。

2 牛蛙的特异性免疫系统

2.1免疫器官与组织

牛蛙的主要免疫淋巴器官包括胸腺、骨髓、脾脏等各种组织以及分布于各组织器官的淋巴组织。

（1）胸腺（thymus）

牛蛙的胸腺是从六鳃囊时期开始形成，位于第二对鳃囊的背壁。呈结实的卵圆体，位于鼓膜后侧，为下颚降肌所掩盖。牛蛙的胸腺存在退化现象，可分为正常性退化和偶然性退化两种。正常性退化与一年四季变化有关，是短暂的。从初春到初秋，胸腺高度发达，机体的免疫功能强；而从秋季中期开始到冬季结束，胸腺开始退化，机体免疫功能有所下降。有研究结果证实，牛蛙胸腺的季节变化可能与神经内分泌系统中起免疫抑制作用的激素有关。偶然性退化是由于饥饿或疾病引起的，随着这些因素的消除，胸腺退化现象也就消失了。在个体发育中，胸腺是首先发育并起作用的淋巴器官，是T细胞分化、成熟的场所，其功能状态直接决定机体细胞免疫功能，并间接影响体液免疫。

胸腺的表面有一层结缔组织被膜覆盖，其结缔组织向腺部内伸展形成许多间隔，把整个腺体分成若干小叶，小叶的外层为皮质（cortex），内层为髓质（medulla），相邻小叶的髓质彼此相通，而在皮髓质交界处含大量血管。

（2）骨髓（bone marrow）

牛蛙的骨髓是造血器官，也是免疫器官。骨髓分布在股骨和肩胛骨等的骨松质中，是一种海绵状、胶状或脂肪状的组织，由血管，神经，网状组织及基质等组成。网状组织和网状纤维组成的网状组织，构成了骨髓的网架，网孔中充满了各种游离的细胞，有淋巴细胞、单核细胞等。它可分为红骨髓和黄骨髓。红骨髓主要行使造血和免疫功能，但是，当机体发生病变时，其中白细胞数量相对增加，并且还能看到许多细胞发生变形，尤其是红细胞；黄骨髓主要是脂肪细胞，无造血功能。

骨髓虽然最早出现于蛙类，但是，牛蛙骨髓中的免疫功能还有待深入研究。

（3）脾脏（spleen）

牛蛙的脾脏为暗红色的小圆形体，是唯一具有特定形态结构的外周免疫器官，组织结构常因种类不同而存在较大的差异。脾脏的实质可分为白髓和红髓，两者的分界边缘也因种类的不同而有所不同，但是红髓中都没有淋巴小结，也无典型的淋巴鞘结构。由淋巴组织环绕动脉形成的白髓，只有在牛蛙中才出现，并且发育不完善。

牛蛙的脾脏能够制造出一定量的红细胞，而且还能制造出大量的淋巴细胞。在牛蛙蝌蚪时期，体内的T淋巴细胞就首先在脾脏中出现。脾脏白髓中有分布密集的B淋巴细胞，牛蛙脾脏白髓中B淋巴细胞的含量就可达82.67±3.51%，由脾索和脾窦组成的红髓B淋巴细胞分布稀疏，其B淋巴细胞主要分布在脾索的周围。

（4）肾脏（kindey）

牛蛙的肾脏位于腹腔背中线的两侧，平等排列，颜色深红，长而扁平，内含许多肾细管。原肾出现于胚胎期，生长期代之以中肾，具有排泄、贮存钙和氯化物的功能。肾脏也分皮质部与髓质部。

牛蛙的肾脏具有造血功能，其血细胞是机体免疫的重要成分。在研究牛蛙胚胎和幼体时期的免疫应答过程中，抗体首先是在前肾中出现，然后才达到肝脏和其它部位。在牛蛙肾、肝在个体发育中是最早出现B细胞的场所。但是有关牛蛙的肾脏和肝是否是其免疫器官，还有待更进一步的组织化学研究验证。

（5）淋巴结和肠系淋巴组织（GALT）

牛蛙无淋巴结，在牛蛙体内看到淋巴髓样结，但是在组织学上与哺乳动物的淋巴结不同。淋巴髓样结主要功能是滤血器官。它是在淋巴腔中聚集了一些淋巴样和髓样细胞，这类细胞在成年牛蛙中位于颈部和腋下部。

肠系淋巴组织最早出现在最低等的脊椎动物（无颌类）。牛蛙的肠系淋巴组织类似于哺乳动物的粘膜淋巴组织（MALT），它存在于牛蛙的整个小肠区。GALT可作为肠中的抗原进入组织细胞的第一道防线。

2.2牛蛙的细胞免疫（cellular immunity）

细胞免疫狭义的是指T细胞接受抗原刺激变成致敏细胞后乃分化繁殖成具有免疫活性的细胞，从而随血液或淋巴液流动到达抗原所在地，通过与抗原的直接接触，才分泌出免疫活性物质，发挥免疫作用。

国内外许多学者在研究牛蛙的免疫系统时，对淋巴细胞进行了大量的研究，发现牛蛙免疫系统的能力呈季节性的变化，对温度非常敏感。在冬季冬眠时测得，牛蛙体内T淋巴细胞分裂增殖能力减弱，体内循环系统和初级、次级淋巴器官中的淋巴细胞明显减少。但是随着外界温度的上升，淋巴细胞的数目上升，其免疫能力逐渐回升。牛蛙的T淋巴细胞表面存在同一分化群抗原，如CD2、CD4、CD5和CD8抗原和主要组织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ抗原。牛蛙CD8+T淋巴细胞还参与同种皮肤移植的急性排斥反应，直接将供体的表皮细胞杀死，因而推测其可能是毒性细胞和NK（nature killer cell）细胞的来源细胞。

2.3牛蛙的体液免疫（humoral immunity）

牛蛙在抗原刺激下，使B细胞活化、增殖、分化为浆细胞，分泌抗体，抗体与抗原接触后发生一系列的反应，从而引起体液免疫应答。在牛蛙中有Ig重链的3种同种型，即IgM、IgY和IgX。其中IgY可能类似于哺乳动物的IgG，IgX可能类似于IgA。通过电泳分析，牛蛙抗体存在高分子量18S和低分子量7S两类，18S通过验证是类似人IgM的抗体，关于7S，有人认为是类似人的IgG，至今尚没有统一的结论。

胚胎和幼体期牛蛙的B淋巴细胞不如成体B淋巴细胞，但是被抗原激活后同样可以产生成体所产生的抗体。牛蛙产生抗体对温度有明显的依赖性，温度越高，抗体出现的时间就越快，而最终的效价是一样的。牛蛙对抗原的反应包括初应答和再应答，应答反应的速度比鱼类快，在高温下更快。同哺乳动物相比，牛蛙产生的抗体种类少，随着免疫时间的延长，其抗体链之间的亲和力很少增加。在回忆应答（anamnestic response）过程中，牛蛙所产生的抗体量很少，其抗体效价和亲和力也很小，但是较初次应答（primary response）的抗体效价都要高。

二、

对养殖牛蛙实施免疫预防传染性疾病的可行性分析

鉴于牛蛙已经具备了比较完善的免疫系统，对于来自体外的具有抗原性（antigenicity）物质，能产生非特异性和特异性的免疫应答。在牛蛙产生的非特异性免疫应答过程中，受免牛蛙体内能够分泌出多种具有特殊生理和药理作用的生物活性物质，这些物质能抵御外来的入侵生物，能起到预防各种传染性疾病发生的作用。在牛蛙特异性免疫应答过程中，受免牛蛙体内能产生特异性抗体以及各种免疫细胞因子，能特异性地防御或杀灭外来的入侵生物，达到特异性地预防某种致病性生物入侵牛蛙机体的目的。因此，牛蛙的养殖业者无论是采用多糖类免疫调节剂（immunomodulator），通过免疫调节牛蛙的免疫系统的免疫防御功能，还是采用某种致病性生物（病毒、细菌等）制备成各种疫苗（vaccine）接种牛蛙，通过刺激受免牛蛙的特异性免疫应答，均有可能达到免疫预防养殖牛蛙传染性疾病发生与危害的目的。

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作者：华中农业大学陈昌福；武汉科研时代生物技术有限公司周鑫军。

编辑：郑燕云

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