新应用 │ 国自然新热点：R-loop CUT&Tag实验指南|dna|rna|信号|国自然新热点|抗体|细胞|蛋白

转自：诺唯赞生物

R-loop是一种很早就被发现的三链核酸结构，近年来逐渐受到科研人员的关注，R-loop相关的文章报道也逐年增多，有成为国自然新热点的趋势。

R-loop是由一条RNA单链侵入双链DNA，与其中一条DNA链互补结合，从而释放出一条DNA单链而形成的一种特殊的三链核酸结构。它通常会出现在基因密度高的活跃转录的起始区和高GC区域，在调控基因转录和影响基因组稳定性方面起着重要作用。

图1. R-loop结构与功能[1]

那么如何知道细胞内DNA哪些位置上存在R-loop结构呢？

研究者发现有一种叫做S9.6的抗体可以特异性识别DNA:RNA杂合链，与双链RNA相比，S9.6对相同序列的杂合链表现出超过100倍的亲和力，对双链DNA则没有明显结合。2022年3月，有研究人员在Nature Communications杂志上发文解析了S9.6抗体结合DNA-RNA杂合链的复合体共晶体结构，揭示了S9.6单抗特异辨识R-loop的分子基础：S9.6不对称地识别杂合链中的RNA和DNA链，主要通过识别两个连续核糖的2'-羟基以实现对RNA链的结合，并通过识别主链磷酸和脱氧核糖基团以实现对DNA链的结合[2]。

图2. S9.6抗体结合DNA-RNA杂合链的晶体结构示意图[2]

有了特异性的抗体，研究者便想到可以使用CUT&Tag的方法来获得R-loop的分布位点，R-loop CUT&Tag技术由武汉大学梁凯威/房萍萍课题组于2021年2月首次发表在Science Advances杂志上[3]。

相比传统的DRIP-seq技术,R-loop CUT&Tag大幅简化了流程，它无需交联、超声、免疫沉淀、加接头建库等复杂步骤，细胞量要求少，peak富集好，背景低，适用于研究者快速高效的获得细胞内R-loop分布位点，丰富基因转录的表观调控机制。那么R-loop CUT&Tag的实验怎么做呢？

R-loop CUT&Tag实验指南

R-loop CUT&Tag实验与常规目标蛋白的CUT&Tag实验步骤基本一样，主要包括细胞与ConA beads结合（细胞无需交联），细胞膜打孔，分别孵育一抗、二抗、pA/G-Tn5，清洗后转座，回收片段化产物后进行扩增。

二者仅在阴性对照、转座后的产物这两点有区别：

区别一：阴性对照

目标蛋白CUT&Tag通常只做一种阴性对照：不加一抗，或加入IgG抗体。而R-loop CUT&Tag实验，建议额外增加一种阴性对照：先加入RNase H或RNase A消化R-loop中的RNA链，此时R-loop的丰度大幅减少或消失，再加入一抗S9.6，则S9.6抗体的结合减少或不能结合，信号相比阳性样本减少或消失，从而发挥了阴性对照的作用，以此说明阳性信号的真实性。部分高GC的DNA-RNA杂交体对RNase H具有抗性，因此阴性对照的信号可能不会完全消失。

图3. RNase H消化R-loop的CUT&Tag阴性对照[3]

区别二：转座后的产物

目标蛋白结合的双链DNA被Tn5转座后得到的是含有接头序列的双链DNA；S9.6结合的DNA:RNA杂合链被Tn5转座后得到的则是含有接头序列的DNA:RNA杂合链和双链DNA（转座位点在杂合链外端时）。之后的扩增，R-loop CUT&Tag可以与常规目标蛋白CUT&Tag一样直接使用诺唯赞CUT&Tag试剂盒（TD903/TD904）中的扩增模块，正常扩增即可。另外，R-loop CUT&Tag还可以使用诺唯赞转座酶法快速RNA建库（TR501/TR502/TR503）中的扩增模块和体系进行扩增，该试剂盒在一链cDNA合成后针对DNA:RNA杂合链进行转座后扩增，其链置换延伸效率更高。